覃容贵 曹旭林 徐昌艳 邓强 周镁 范菊娣

摘要 [目的]建立贵州宽叶缬草地上部分总黄酮含量测定方法，确定贵州宽叶缬草兼顾地上部分和药用部位的适宜采收期。[方法]采用紫外分光光度法测定不同采收期宽叶缬草药用部位与地上部分总黄酮含量，并运用主成分分析法确定黔产宽叶缬草适宜采收期。[结果]芦丁在0.010 0～0.080 0 mg/mL线性关系良好，加样回收率为101.02%，RSD值为2.01%。不同采收期宽叶缬草药用部位与地上部分总黄酮含量呈动态变化，由高到低依次为7月份、8月份、6月份、5月份、4月份、3月份，7月份采收的宽叶缬草综合评价指数最高。[结论]所建立的含量测定方法具有操作简便、结果准确、重复性好等特点，可用于宽叶缬草地上部分总黄酮含量测定；7月份为宽叶缬草适宜的采收期。

关键词 宽叶缬草；总黄酮；主成分分析法；采收期

Study on Harvest Period of Valeriana officinalis from Guizhou Province

QIN Rong-gui，CAO Xu-lin，XU Chang-yan，FAN Ju-di* et al （Guizhou Medcial University， Guiyang，Guizhou 550025）

Abstract [Objective] The research aimed to establish the method for the content determination of total flavones from the aerial parts of Valeriana officinalis，and determine the optimal harvesting period of the aerial parts and medicinal parts of Valeriana officinalis from Guizhou Province.[Method]Ultraviolet visible spectrophotometry was used to determine the total flavonoids contents of medical and aerial parts in Valeriana officinalis，which were from different collection period， and principal component analysis （ PCA） was used to confirm the optimal harvesting time.[Result]Rutin showed good linear relationship in the concentration range of 0.010 0-0.080 0 mg/mL， the recovery rate was 101.02%， RSD was 2.01%.There were dynamic changes of the total flavones contents in the samples of different harvest month. It was as follows in descending order： July，August，June，May，April，March， the comprehensive evaluation index of samples collected in July was better than others.[Conclusion]The established method is simple， accurate，repeatable， and can be used for quality control of the aerial parts of Valeriana officinalis. The optimal harvest period of Valeriana officinalis is July.

Key words Valeriana officinalis；Total flavones；Principal component analysis；Harvest period

宽叶缬草为败酱科缬草属植物宽叶缬草（Valeriana officinalis L. var.latifolia Miq.）的干燥根及根茎，常生于林下、沟边以及高山山坡，广泛分布于我国东北至西南等地[1]，为贵州省中药民族药材质量标准2003版收载品种[2]。目前，在贵州江口县和剑河县已经建立了规模化的缬草种植基地。

缬草生物活性广泛，疗效明显，安全性好，是一种很有开发前景的中药资源[3]。目前，缬草提取物及制剂在国际市场上十分走俏，是美国十大畅销天然产物制剂之一，我国宽叶缬草的研究开发也取得了一定成果，但还不够系统深入[4-6]。宽叶缬草传统入药部位为根和根茎，采收期多在7—8月份，此时地上部分也正是生长旺盛时期，但都被丢弃不用。现代研究表明，缬草中含有挥发油、环烯醚萜、有机酸、生物碱、黄酮等化学成分[7-8]。其中黄酮类化合物在临床上应用非常广泛，常用于抗肿瘤、防治心脑血管和呼吸系统疾病等[9-10]。覃容贵等[11]研究发现，寬叶缬草地上部分富含黄酮类成分，如加以利用，将有利于提高宽叶缬草的经济价值。笔者立足于贵州丰富的宽叶缬草资源，建立贵州宽叶缬草地上部分的总黄酮含量测定方法，测定其不同采收期药用部位和地上部分总黄酮含量，通过主成分分析确定贵州宽叶缬草兼顾地上部分和药用部位的适宜采收期，为宽叶缬草规范化种植提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材。从贵州省江口县宽叶缬草种植基地某固定区域内随机采集宽叶缬草生长期各月份样品，药材经鉴定为败酱科植物宽叶缬草（Valeriana officinalis L. var.latifolia Miq.）。

1.1.2 试剂。对照品芦丁（中国药品生物制品检定所，批号100080200707）；亚硝酸钠（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20130110）；硝酸铝（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20071118）；氢氧化钠（重庆川东化工有限公司，批号20130601）；三氯化铝、乙醇等均为分析纯，水为蒸馏水。

1.1.3 仪器。AL204电子天平[梅特勒—托利多仪器（上海）有限公司]；紫外可见分光光度计（岛津UV-2401）；MH-2000 调温型电热套（北京科伟永兴仪器有限公司）；101-1型电热恒温鼓风干燥箱（上海路达实验仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 对照品溶液的制备。精密称取芦丁对照品适量，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇溶解、定容，摇匀，制成浓度为0.2 mg/mL的对照品溶液。

1.2.2 提取溶剂和最大吸收波长的选择。精密称取3份宽叶缬草地上部分1 g，分别置于索氏提取器装置中，加石油醚100 mL加热回流提取至提取液无色，药渣挥去石油醚，分别加入80 mL 50%、75%、95%乙醇继续提取至无色，提取液放置室温后转移至100 mL容量瓶，分别用不同浓度乙醇定容至刻度，摇匀，作供试品溶液[12]。

精密量取1 mL供试品溶液于10 mL容量瓶中，加入不同浓度乙醇至5.0 mL，再分别加入5% NaNO2试剂0.3 mL，摇匀，静置6 min，加10% Al（NO3）3试液0.3 mL，摇匀，静置6 min，再加4% NaOH试液4 mL，用不同浓度乙醇溶液定容至刻度，摇匀，静置15 min，在200～700 nm处进行全波长扫描[13]。

1.2.3 显色剂的选择。

1.2.3.1 0.1 mol/L AlCl3显色。分别精密量取对照品与宽叶缬草地上部分供试品溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，精密加入3 mL 0.1 mol/L AlCl3 溶液，再加入4 mL 1 mol/L NaAc溶液，摇匀，置恒温水浴锅（20 ℃）显色2 min，取出，用80%乙醇定容，冷却。以随行试剂为空白，于200～700 nm处进行全波长扫描[14-15]。

1.2.3.2 0.5 mol/L AlCl3显色。分别精密量取对照品与宽叶缬草地上部分供试品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL 0.5 moL/L A1Cl3溶液，摇匀，放置15 min，再用pH 6.0 HAc-NaAc缓冲溶液定容，摇匀，超声振荡5 min，以随行试剂为空白，于200～700 nm处进行全波长扫描。

1.2.3.3 5% NaNO2-10%Al（NO3）3-4%NaOH显色。分别精密量取对照品与宽叶缬草地上部分供试品溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，加入75%乙醇至5.0 mL，再分别加入5% NaNO2试剂0.3 mL，摇匀，静置6 min，加10%Al（NO3）3试液0.3 mL，摇匀，静置6 min，加入4 mL 4%NaOH溶液，用75%乙醇水溶液定容至刻度，摇匀，静置15 min，于200～700 nm处进行全波长扫描[16]。

1.2.4 方法学考察。

1.2.4.1 标准曲线的绘制。精密量取芦丁对照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL于10 mL具塞试管中，加入75%乙醇至5.0 mL，再分别加入5% NaNO2试剂0.3 mL，摇匀后静置6 min，加10%Al（NO3）3试液0.3 mL，摇匀静置6 min，再加4% NaOH试液4 mL，用75%乙醇水溶液定容至刻度，摇匀静置15 min。以未加标准品的溶液为空白对照，于508 nm处测定吸光度。以芦丁质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.4.2 精密度试验。称取宽叶缬草地上部分0.5 g，精密称定，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，精密量取2 mL于10 mL具塞试管中，按照“1.2.4.1”方法从“加入75%乙醇至5.0 mL”起，显色，于508 nm波长处测定吸光度，连续重复测定吸光度6次。

1.2.4.3 重复性试验。取同一批宽叶缬草地上部分6份，各0.5 g，精密称定，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，精密量取2 mL于10 mL具塞试管中，按照“1.2.4.1”方法从“加入75%乙醇至5.0 mL”起，显色，于508 nm波长出测定吸光度。

1.2.4.4 稳定性试验。取宽叶缬草地上部分0.5 g，精密称定，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，精密量取2 mL于10 mL具塞试管中，按照“1.2.4.1”方法从“加入75%乙醇至5.0 mL”起，显色，每隔20 min于508 nm处测定，持续2 h。

1.2.4.5 加样回收率试验。精密称取已知总黄酮含量的宽叶缬草地上部分0.25 g，共9份，精密称定，在已知总黄酮含量的宽叶缬草地上部分中按1.0∶0.8、1.0∶1.0、1.0∶1.2的比例加入对照品，每个比例做3份，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，精密量取2 mL于10 mL具塞试管中，按照“1.2.4.1”方法從“加入75%乙醇至5.0 mL”起，显色，于508 nm处测定吸光度。

1.2.5 宽叶缬草地上部分样品总黄酮含量的测定。取同一产地不同采收期宽叶缬草地上部分约0.5 g，精密称定，按“1.2.2”方法制备供试品溶液，精密量取2 mL于10 mL具塞试管中，按照“1.2.4.1”方法从“加入75%乙醇至5.0 mL”起，显色，于508 nm处测定吸光度，计算总黄酮含量。

1.2.6 不同采收期宽叶缬草药用部位总黄酮含量的测定。参照周镁等[17]测定黔产宽叶缬草根中总黄酮含量的方法，对同一产地不同采收期宽叶缬草药用部位总黄酮含量进行测定。

1.3 数据处理 运用SPSS 17.0 统计软件，采用主成分分析对不同采收时间宽叶缬草药用部位和地上部分总黄酮2个指标成分的含量测定结果进行分析评价。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂和最大吸收波长的选择 由图1可知，各浓度乙醇提取的宽叶缬草供试品溶液于200～700 nm扫描时，峰形基本一致，最大吸收波长为508 nm，其75%乙醇提取供试品溶液吸光度较大，故选择75%乙醇为提取溶剂。

2.2 显色剂的选择 分别对0.1 mol/L AlCl3显色、0.5 mol/L AlCl3显色、5% NaNO2 -10%Al（NO3）3-4% NaOH 显色进行比较，结果发现（图2），5%NaNO2 -10%Al（NO3）3-4% NaOH显色对照品与供试品溶液在508 nm处均有最大吸收，因此确定以5%NaNO2 -10%Al（NO3）3-4% NaOH显色体系用于宽叶缬草地上部分总黄酮显色。

2.3 方法学考察

2.3.1 标准曲线的绘制。以芦丁质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得出线性回归方程Y=11.7X+0.001 1（R2=0.999 8），表明芦丁在0.010 0～0.080 0 mg/mL与吸光度呈现良好的线性关系。

2.3.2 精密度试验。按照“1.2.4.2”操作，测得吸光度分别为0.270 9、0.271 1、0.270 5、0.271 0、0.270 6、0.270 6，计算RSD值为0.09%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验。按照“1.2.4.3”操作，平行样6份，测得吸光度分别为0.207 2、0.214 0、0.218 5、0.216 5、0.213 6、0.208 8，计算RSD值为2.05%（n=6），表明方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验。按照“1.2.4.4”操作，测得供试品溶液吸光度值分别为0.270 6、0.269 0、0.266 3、0.264 6、0.263 5、0.262 5，计算RSD值为1.20%（n=6）。表明供试品溶液在显色后2 h内稳定。

2.3.5 加样回收率试验。由表1可见，芦丁的平均加样回收率为101.02%，RSD值为2.01%。表明该方法回收率较好，方法可行。

2.4 不同采收期宽叶缬草地上部分和药用部位总黄酮含量 由表2可知，宽叶缬草地上部分总黄酮含量远高于药用部位，药用部位总黄酮含量在3—4月份激增，之后小幅增长，7月份达高峰，8月份下降；而地上部分推迟1个月，在4—5月份迅速增高，之后缓慢增长，7月份达高峰，8月份下降。直观分析，兼顾地上部分及药用部位宽叶缬草适宜的采收期在7月份。

2.5 主成分分析确定宽叶缬草最佳采收期 运用主成分分析对不同采收时间宽叶缬草药用部位和地上部分总黄酮含量测定结果进行分析评价，结果发现，根据特征值可以排列主成分名次λ1=1.737>λ2=0.263；从贡献率以及累计贡献率来看，第1主成分方差贡献率最大，为85.979%，当累计贡献率达到70%即认为比较满意[18]，所以取第1主成分即可基本反映总体情况，达到降维的目的。根据特征向量各元素标准化值的线性组合，可得到主成分线性组合表达式为：F=AF1=0.87F1，其中A=λ1 /（λ1+λ2），F1=0.707B1+0.500 B2（B1、B2为各成分含量标准化后的数据）。

按上述主成分表达式，计算出不同采收时间宽叶缬草样品综合主成分评价值并排序（表3），确定最佳采收期。根据综合评分值的排序（表3）可以看出，排序第一的采收时间在7月份，说明7月份药材包含了2种指标成分的最佳综合信息，可将7月份确定为宽叶缬草药材的最佳采收期。

3 讨论与小结

3.1 宽叶缬草适宜采收期的确定 药材采收期确定应综合考虑有效成分的积累动态与药用部位的生长动态。宽叶缬草作为药材，其传统药用部位为根和根茎，具有安神镇静、驱风解痉、生肌止血、止痛等功效，由于其特征性成分环烯醚萜类含量极低，稳定性差，样品间含量无明显差异性，不宜作为检测指标；而黄酮类成分含量较高，易于测定，样品间含量差异性显著，且其抗肿瘤、防治心脑血管和呼吸系统疾病作用良好，因此该研究选用黄酮类成分作为检测指标，研究寬叶缬草中有效成分的累积动态。从累积动态来看，药用部位从4月份开始、地上部分从5月份开始总黄酮含量即无明显提高；从生长动态来看，7、8月份是贵州江口、剑河宽叶缬草生长旺盛期，9月份植株倒苗。综合考虑，宽叶缬草有效成分含量高峰期与药用部位产量高峰期在7、8月份，8月份总黄酮含量稍有下降，因此其最佳采收期在7月份。从主成分分析结果来看，药用部位总黄酮含量为第1主成分，累积贡献率大，为采收期确定的主要考察因素。7月份药材包含了2种指标成分的最佳综合信息，因此可将7月份确定为宽叶缬草药材的最佳采收期。在实际生产中，贵州江口、剑河宽叶缬草产区传统采收期在7、8月份，8月份地上部分和药用部位总黄酮含量均有所下降，为确保药材质量和经济价值，建议在7月份采收较为适宜。

从总黄酮含量来看，宽叶缬草地上部分总黄酮含量远高于药用部位，在产区地上部分常常被丢弃不用，浪费了宝贵的药用植物资源，非常可惜。曾有公司将其经简单加工制成袋泡茶，有较好的安眠作用。建议7月份采收后，将地上部分进行开发利用，实现药材经济价值最大化。

3.2 宽叶缬草地上部分总黄酮含量测定中色素的处理 除色素问题是以地上部分（全草）入药的中药材采用紫外-可见分光光度法进行含量测定必须解决的问题。缬草药材虽不是全草入药，但为了开发其地上部分，在测定地上部分总黄酮时为了减小样品溶液本身的颜色对显色效果的影响，故应考虑除去地上部分的色素。试验过程中探讨了样品除色素与不除色素对总黄酮含量测定的影响，结果发现差异确实较大，说明色素对总黄酮测定的影响较大，因为色素是属于小极性的物质，用极性较小的石油醚除去即可，且因石油醚极性较小，不会影响黄酮类物质的提取。