林霖，宋关玲*，曾宏梅，万真真，刘龙龙，桑璐，徐张瑞，雷伟

（石河子大学医学院，新疆 石河子 832000）

纳米二氧化钛对雌性小鼠肾脏的影响

林霖，宋关玲*，曾宏梅，万真真，刘龙龙，桑璐，徐张瑞，雷伟

（石河子大学医学院，新疆 石河子 832000）

为研究在亚急性毒性的情况下，纳米二氧化钛（TiO2）对雌性小鼠肾脏的影响。采用将60只ICR雌性小鼠随机分为对照组和三个剂量组（10、50、100 mg/kg BW）的方法，连续30 d灌胃染毒。小鼠脱颈处死，称量并计算肾脏系数，观察肾组织病理学变化和氧化损伤，并检测肾功能。结果显示，纳米TiO2染毒导致小鼠肾脏组织出现不同程度炎细胞浸润，间质充血、纤维素样坏死等损伤，且剂量越大，损伤越明显；各剂量组小鼠肾脏系数和肾组织BUN含量与对照组无显著性差异（P＞0.05），而肾组织Cr含量明显升高（P＜0.05），UA含量随剂量升高逐渐下降，当剂量达到100 mg/kg时与对照组相比差异显著（P＜0.05）；小鼠肾组织SOD活性随染毒剂量增加呈先升后降的趋势，且50 mg/kg剂量组SOD活性显著性高于对照组（P＜0.05）；与对照组相比，10 mg/kg剂量组和50 mg/kg剂量组小鼠肾组织GSH-PX活性显著性升高（P＜0.05），各剂量组小鼠肾组织MDA含量明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。由此可知，纳米TiO2染毒使雌性小鼠肾组织产生病理学变化，造成肾功能损伤，并引起肾组织的氧化应激反应。

纳米TiO2；肾脏；毒性；氧化应激

近年来，纳米技术迅猛发展，纳米材料的应用越来越广泛，人们对其生物安全性问题的关注也越来越深入。纳米TiO2因其良好的特性（耐化学腐蚀性、热稳定性以及其光催化活性），已被广泛的应用到污水治理领域、医疗保健领域、涂料、塑料领域（主要用于食品的包装）、日常护理用品（如遮瑕膏、美白防晒化妆品等）以及化学化工等各个领域中，堪称我国目前生产量最大、需求量最高、应用范围最为广泛的一种纳米材料［1］。纳米TiO2的广泛使用，尤其是在食品领域的应用及发展，使得人类及动物通过胃肠道途径接触的机会明显增多，因此其引起的生物学效应不容忽视［2-3］。近年来国内外研究证明纳米TiO2对生物体有一定的毒性［4］，能够造成对肝脏、脾、肺等器官的损伤，且其损伤可能与其引起的氧化应激有关［5-8］。本研究以雌性ICR小鼠为研究对象，在构建纳米TiO2灌胃染毒模型的基础上，探讨纳米TiO2对肾脏的亚急性毒性，为纳米二氧化钛的生物安全性评价提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

锐钛矿型纳米二氧化钛购自上海晶纯生化科技股份有限公司；丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）和蛋白定量试剂盒购自南京建成生物工程研究所。xMark酶标仪，美国Bio-Rad公司；H-600透射电镜，日本Hitachi公司；ZEN3690激光粒度仪，英国马尔文公司；CX21FS1光学显微镜，日本Olympus公司。

1.2 样品表征及制备

采用透射电子显微镜分析纳米TiO2颗粒的粒径，使用激光粒度仪测量样品的流体力学粒径和zeta电位值。

1.3 实验动物及染毒方式

SPF级ICR雌性小鼠 60只（体重25±3 g），购自新疆医科大学［许可证号：SCXK(新)2013-0001］。饲养环境温度为（25±3）℃，相对湿度50%±10%，昼夜均为 12 h。动物自由摄食饮水，适应一周后随机分为溶剂对照组（PBS缓冲液）和3个不同纳米TiO2剂量组（10、50和 100 mg/kg），共 4组，每组 15只。用PBS将事先称好的纳米TiO2配制成相应浓度悬浮液，超声30 min，结束后15 min之内给小鼠灌胃。各组小鼠每日灌胃1次，连续30 d，染毒结束次日麻醉剖杀，取材做相关指标检查。

1.4 观察指标

小鼠处死后取肾脏称重，按照公式：肾脏系数（‰）=（肾脏重量（g）/小鼠体重（g））×1000‰，计算肾脏系数；切取适量肾脏组织经4%中性甲醛溶液固定，制作病理切片，HE染色，光学显微镜下观察小鼠肾脏组织病理学变化；其余肾脏用生理盐水制备成10%的组织匀浆，按照试剂盒说明书检测肾功能指标（UA，BUN，Cr），氧化应激相关指标（SOD 活性，GSH-PX活性，MDA含量）。

1.5 统计处理

实验数据采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，组间比较使用单因素方差分析（one-way ANOVA）；两组组间比较及组内比较使用t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 纳米TiO2的表征

实验所用的锐钛矿型纳米TiO2购自于上海晶纯公司，透射电镜结果显示纳米TiO2颗粒接近球形，晶体分布较为均匀，粒径为5-10 nm（图1）。激光粒度仪检测结果显示低、中、高剂量组纳米TiO2悬浮液平均流体力学粒径分别为 700、500、350 nm（图2），zeta电位均为 -30 mV 左右（图 3）。

图1 纳米TiO2的透射电子显微镜图Fig.1 Transmission electron micrographs of nano-TiO2

图2 纳米TiO2的流体力学粒径Fig.2 Hydrodynamic particle size of nano-TiO2

图3 纳米TiO2悬浮液的zeta电位Fig.3 Zeta potential of nano-TiO2suspensions

2.2 小鼠肾脏系数的变化

小鼠肾脏系数的变化见图4。

图4 纳米TiO2对雌性小鼠肾脏系数的影响Fig.4 Effect of nano-TiO2on the female mice kidney coefficient

小鼠的肾脏系数与对照组(8.24±0.21 mg/g)相比，10、50和100 mg/kg剂量组小鼠的肾脏系数分别为8.33±0.31 mg/g、8.58±0.23 mg/g、8.63±0.37mg/g，均有升高的趋势，但差异不具有统计学意义（P＞0.05）（图4）。

2.3 小鼠肾组织病理学观察

雌性小鼠肾组织病理切片见图5。对照组小鼠肾脏在光学显微镜下肾小球和肾小管结构清晰，肾小管上皮细胞排列紧密，细胞结构完整。在10 mg/kg剂量组可见肾间质充血（图5B）。50 mg/kg剂量组可观察到间质充血和肾小管上皮细胞水肿（图5C）。当纳米TiO2剂量达到100 mg/kg时可观察到肾脏组织细胞排列疏松，有炎细胞浸润，还可见部分肾小管细胞脂肪空泡，细胞脱落以及肾小管组织纤维化（图 5D）。

图5 小鼠肾脏HE染色结果（×200）Fig.5 HE staining of mice kidney(×200)

2.4 小鼠肾功能指标

小鼠肾组织Cr含量随着纳米TiO2剂量增加逐渐升高，且与对照组相比均有统计学意义（P＜0.05）（图6A）；各剂量组小鼠肾组织中UA含量均有所下降，且100 mg/kg剂量组UA含量显著性低于对照组（P＜0.05）（图 6B）；与对照组相比，各剂量组 BUN 含量未见明显改变（图6C）。

图6 纳米TiO2对小鼠肾功能指标的影响Fig.6 The effects of nano-TiO2on the mice kidney function indicators

2.5 小鼠肾组织氧化应激指标

随着纳米TiO2染毒剂量的增加，小鼠肾组织中SOD活性和GSH-PX活性均呈先升高后降低的趋势，与对照组相比，50 mg/kg剂量组SOD活性显著性升高 （P＜0.05），10 mg/kg、50 mg/kg剂量组 GSH-PX活性显著性升高（P＜0.05）（图 7A、B）。与对照组相比，各纳米TiO2处理组小鼠肾组织中MDA含量均明显增加，差异均具有统计学意义（P＜0.01，图7C）。

图7 纳米TiO2对小鼠肾组织氧化应激指标的影响Fig.7 The effects of nano-TiO2on the oxidative stress indicators of mice kidney tissues

3 讨论

纳米材料的尺寸决定了其比表面积大小，粒径越小，比表面积越大，越容易被生物体吸收，进而影响其与细胞和机体作用的方式和毒性。如Oberdorster等人［9］发现相比于 250 nm的颗粒，吸入 25 nm的TiO2纳米颗粒能诱导更强的肺部炎症反应。本实验所使用的纳米材料为粒径5-10 nm的锐钛矿型纳米TiO2，且其在PBS溶液中的粒径随浓度增加而降低，表明随着染毒剂量的增加，纳米TiO2被机体吸收的能力也在增加。Zeta电位值与胶体分散稳定性有关，一般认为zeta电位值高于+30 mV或低于-30 mV表示悬浮液较为稳定［10］。本实验结果表明，实验所配制的纳米TiO2悬浮液的zeta电位值均在-30 mV左右，稳定性良好。

在本实验条件下，与对照组相比，各剂量组小鼠的肾脏系数有升高的趋势，但差异不具有统计学意义（P＞0.05），同梁戈玉等［11］气管滴注染毒结果一致。小鼠肾组织病理学结果显示，纳米TiO2剂量组与对照组相比，出现明显损伤，且随着染毒剂量的增加，损伤作用也更加明显，此结果和王燕［12］等大剂量一次灌胃染毒结果相似，所有结果显示纳米TiO2染毒会对肾组织产生病理学变化。

Cr是人体肌肉磷酸肌酸在机体内的最终代谢产物，当肾脏功能受损时，机体内的Cr排泄受阻，血清Cr含量就会升高［13］。然而在肾脏功能出现异常的早期，血清中Cr值一般不升高，直到肾脏出现实质性损伤时，血清中的Cr含量才会增加［14］。因此，血Cr的变化能较准确的反映肾小球滤过率。本试验中，50、100 mg/kg剂量染毒造成小鼠肾脏中Cr含量明显升高，说明较高剂量纳米TiO2染毒可对肾脏造成实质性损伤，使肾小球滤过率降低，肾功能下降，这和Hong［15］的纳米TiO2慢性毒性研究结果基本一致。

UA是机体内嘌呤的代谢终产物［16］，正常情况下，生物体每日UA的摄入量与排出量保持动态平衡［17］。当生物体受到自由基的攻击时，UA被过度消耗而导致水平降低［18］。BUN是蛋白质代谢的主要产物之一，经肾脏排泄，当肾小球滤过功能出现异常时，BUN水平也会发生改变［19］。本研究中，与对照组相比，各剂量组UA含量逐渐降低，且剂量达到100 mg/kg时差异显著，而不同剂量纳米TiO2组小鼠肾组织中的BUN含量均未见明显差异。推测在此条件下，纳米TiO2对肾脏的影响不足以引起BUN的改变，而Cr和UA对纳米TiO2的反应更为敏感。

SOD和GSH-PX是机体内两种重要的抗氧化剂［20］。本试验中，纳米TiO2染毒小鼠SOD活性和GSH-PX活性均表现为先升高后降低的趋势，推测在纳米TiO2染毒剂量较低时，小鼠肾脏表现为应激补偿效应，即氧化胁迫的作用导致SOD活性和GSH-PX活性代偿性增强，从而在一定程度上减少纳米TiO2对小鼠造成的氧化损伤，但随着染毒剂量的增加，“毒物抑制效应”使得SOD活性和GSH-PX活性降低，说明此时机体清除活性氧的能力降低。

MDA可作为衡量自由基代谢程度以及自由基引起膜脂质过氧化的标志物［21］。本研究结果显示，小鼠肾组织中MDA含量随着纳米TiO2染毒剂量的增加而逐渐升高（P＜0.05），同 Hu［22］等的研究结果基本一致。以上结果说明，小鼠暴露于纳米TiO2时促使机体发生了氧化应激反应，而随着机体抗氧化酶如SOD、GSH-PX活性的失代偿，使得体内产生的ROS不能被彻底的清除，从而导致细胞受到膜脂质过氧化损伤，机体氧化-抗氧化系统失衡，最终造成小鼠肾脏的损伤。

综上所述，本实验条件下，纳米TiO2对雌性小鼠经口灌胃在一定程度上引起了雌性小鼠的肾脏组织病理性损伤，对小鼠肾功能造成了影响，并引起了肾组织的氧化损伤。由此可见，食品当中添加的纳米TiO2会对动物的肾组织产生一定的作用，其安全性值得我们重视和更加深入的研究。

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Effect of nano titanium dioxide on the kidney of female mouse

Lin Lin，Song Guanling*，Zeng Hongmei，Wan Zhenzhen，Liu Longlong，Sang Lu，Xu Zhangrui，Lei Wei
(School of Medicine,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832000,China)

The subacute toxic effects of nano titanium dioxide (TiO2)on the kidney of female mice were studied in this research.60 female ICR mice were randomly assigned into 10,50 and 100 mg/kg nano-TiO2groups and control group(phosphate buffer solution).After 30 consecutive days of intragastric administration of corresponding nano-TiO2,the mice were sacrificed.Then the kidney were used for assessing tissue coefficient and pathological changes;and the level of renal functions indices and oxidative stress markers of kidney were analyzed.Histopathologic examination showed there are various damage in the kidneys of mice exposed to nano-TiO2.There are no significant differences in the renal coefficient and the content of BUN of kidney among the four groups.The Cr content in nano-TiO2treated groups were significant increased compared with that in control group (P＜0.05).The UA content in 100 mg/kg group was significant decreased compared with that in control group(P＜0.05).With the nano-TiO2dosages increased,the activity of SOD and GSH-PX in the kidneys were first increased,and then decreased.Compared with those in control group,the SOD activity in 50 mg/kg dose group and The GSH-PX activity in 10mg/kg and 50 mg/kg BW dose groups were increased significantly(P＜0.05).The MDA content was significantly increased in nano-TiO2treated groups compared with that in control group (P＜0.01).Nano-TiO2can induce the change of renal tissue and functions and the oxidative stress in the kidneys.

Nano-TiO2;kidney;toxicity;oxidative stress

R994.4

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.03.013

1007-7383(2017)03-0344-05

2016-03-29

国家自然科学基金项目（81560536），复旦大学开放课题（FDLAP14003），石河子大学科技发展项目（RCZX201331）

林霖(1991-)，男，硕士研究生，专业方向为纳米毒理学。

*通信作者：宋关玲(1971-)，女，副教授，从事纳米毒理学研究，e-mail:sglhit.student@sina.com。