秦文娟，管东方,史红娟,邢国强,李佳洁,马荣基,吕海龙,姜玉峰*

（1石河子大学医学院人体解剖与组织胚胎学教研室，新疆 石河子 832002；2石河子大学医学院肝胆外科,新疆 石河子 832002；3石河子大学医学院第一附属医院超声诊断科，新疆 石河子 832002

砷中毒对大鼠纹状体神经细胞与肝组织的毒性和氧化应激作用

秦文娟1,3，管东方1,史红娟1,邢国强2,李佳洁1,马荣基1,吕海龙2,姜玉峰1*

（1石河子大学医学院人体解剖与组织胚胎学教研室，新疆 石河子 832002；2石河子大学医学院肝胆外科,新疆 石河子 832002；3石河子大学医学院第一附属医院超声诊断科，新疆 石河子 832002

为研究NaAsO2(亚砷酸钠)中毒对成年SD大鼠纹状体的神经细胞及肝脏形态学的影响,以及NaAsO2中毒对SD大鼠神经毒性和肝毒性的作用,我们对染毒后的组织进行HE染色并观察。采用12周龄 SD大鼠48只 ,体重200±20 g,随机分组:正常对照组(自由饮水),实验组按剂量递增方式分为低、中、高剂量NaAsO2染毒组 (按照5、10、20 mg/kg的比例配制蒸馏水,自由饮用)，各组12只 ,均采用普通饲料喂养,建造染砷模型12周后取大鼠脑组织纹状体部分,常规石蜡切片后,HE染色,光镜观察大鼠纹状体神经细胞与肝结构的形态学是否发生改变 ,同时使用试剂盒检测纹状体与肝组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力（WST-1法）、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)（微板法）及丙二醛(malondialdehyde,MDA)（TBA法）的含量。结果显示，利用苏木素-伊红（HE）染色可见:NaAsO2染毒组的纹状体神经细胞与对照组相比较,神经细胞胞体形态欠规则,数量稀疏且减少,胞浆内可见明显空泡样变,镜下可见坏死水肿的神经细胞。NaAsO2染毒组的肝组织较正常组出现病理性改变:例如变性、坏死、组织出现水肿及炎性细胞浸润等，与对照组相比,各剂量NaAsO2染毒组大鼠的纹状体组织及肝脏的SOD活力，GSH 含量均降低,差异具有统计学意义(P＜0.05);与对照组比较,各剂量NaAsO2染毒组大鼠的纹状体组织及肝脏的MDA含量均升高,差异具有统计学意义(P＜0.05)。由此可知，大鼠纹状体神经细胞形态结构及肝组织结构产生损伤可能由NaAsO2导致其中毒,同时提示NaAsO2致大鼠纹状体及肝组织的毒性作用可能与氧化应激相关。

NaAsO2中毒；纹状体神经元；肝功能；氧化应激

近年来，砷中毒对人类神经系统的毒性损害作用已经逐渐受到科学研究者的关注。目前砷中毒的主要原因是人类饮用水中砷含量过高导致［1］。由于地壳中砷含量极其不均匀，而人类的慢性砷中毒的发生又可以通过多种途径摄入砷的化合物引起，所以目前砷中毒已经成为严重的公共卫生疾病，并且日益受到人们的关注［2］。当人体摄入砷后可对机体的神经、脑、肝脏和肾脏等器官均可累及损害。目前砷中毒主要表现为神经症状和局部皮肤变化，例如能引起皮肤癌等，并会影响基因的表达，从而导致机体产生功能障碍及紊乱［3］。研究表明，过量的砷可以通过血脑屏障，进入中枢和周围神经系统引起脑损伤，主要表现为：认知缺陷及周围神经损伤而产生的周围神经病变，同时还有可导致人或者实验动物出现行为异常以及智力记忆功能障碍［4-5］。当砷在暴露于肝脏后，可能会引起肝功能等脏器的多方面的损伤。目前的研究表明:过量的砷进入机体内会导致肝脏部位病变的产生;而慢性砷中毒有可能破坏在人体中的自由基的生成与清除所保持的平衡状态，从而引起机体相应的抗氧化能力的减低［3］。本研究通过建立SD大鼠染砷模型，探查NaAsO2中毒对SD大鼠纹状体神经细胞及肝脏形态学结构的影响以及氧化应激的作用，为进一步的砷中毒致神经系统损害及脏器损伤机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选用48只12周龄雄性 SD大鼠(新疆医科大学第一附属医院动物实验中心提供)，体重为200±20 g，随机分为空白对照组及低、中、高(NaAsO2为5、10、20 mg/kg 溶液)染毒组，各组 12只，正常对照组可自由饮用蒸馏水。四组大鼠均自由进食普通饲料。饲养环境需模拟自然昼夜条件。持续染毒大鼠12周。

1.2 实验仪器和试剂

NaAsO2(Sigma公司)，超低温 4℃离心机(Thermo公司);倒置相差显微镜 (Olympus);全自动Bio-rad酶标仪;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒（A001-3）。还原型谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH) 试 剂 盒 （A006-2）。 丙 二 醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒（A003-1），试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司。

1.3 取材及标本制备

大鼠连续染毒期满12周后，每组大鼠中随机各取 6只，10%水合氯醛腹腔麻醉后用4%多聚甲醛经心脏再灌注进行固定。开颅取脑，于冰上迅速分离纹状体和大脑皮质组织，并快速用预冷生理盐水冲洗组织3次，离心管加入 适量4%多聚甲醛，进一步固定，取纹状体组织，经组织脱水。二甲苯透明。石蜡包埋后，切片机进行冠状位切片，厚度5 μm，固定切片后进行HE染色，倒置显微镜观察纹状体区神经形态结构。大鼠脱颈处死后，快速分离肝组织并用4%多聚甲醛固定，经脱水。透明。石蜡包埋后切片，进行HE染色，显微镜观察观察大鼠肝组织形态变化。

1.4 纹状体组织中SOD活力和GSH、MDA含量的测定

正常组及染毒组每组各取6只模型鼠，脱颈处死后，于冰上速取纹状体组织，加入到预冷的生理盐水中，使用眼科剪尽快剪碎纹状体组织块，并在超声机超声制成 10%的组织匀浆液，4℃离心机离心取上清液待用。按照试剂说明书分别检测 SOD活力和GSH、MDA的含量。本次实验重复3次。

1.5 肝组织中SOD活力和GSH、MDA含量的测定

正常组及染毒组每组各取6只模型鼠，脱颈处死后迅速取出肝组织，加入到预冷的生理盐水中，使用眼科剪尽快剪碎肝组织块，并在超声机超声制成 10%的组织匀浆液，4℃离心机离心取上清液待用。按照试剂说明书分别检测 SOD活力和GSH。MDA的含量。本次实验重复3次。

1.6 统计学处理

数据以means±SD表示，使用SPSS19.0统计软件，进行显著性t检验以及单因素方差 (ANOVA)统计分析。以P＜0.05为差异有统计学意义，每组实验重复3次。

2 结果

2.1 光镜下纹状体神经细胞形态变化(HE染色)

光镜下，正常对照组:纹状体区神经细胞胞体形态规整，胞质丰富，胞体与胞浆界限清晰可见 (图1A)，低剂量组纹状体神经细胞较正常对照组数量减少，病理改变较轻，可见部分细胞形态欠规则，间质轻度水肿(图1B)。中。高剂量组纹状体神经细胞稀疏 ，胞体形态不规则 ，部分细胞胞浆内可见明显空泡样变，间质水肿坏死明显(图1C、D)。

图1 大鼠纹状体神经细胞HE染色形态变化Fig.1 HE staining morphology changes in rat corpus striatum neurons

2.2 大鼠肝脏组织形态观察结果(HE染色)

阴性对照组大鼠肝组织结构观察正常 (图2A)，肝小叶的结构清晰可见，肝细胞呈现形式:以中央静脉为中心，向周围呈索状放射性分布，组织内未见明显变性坏死及炎性细胞浸润，以及肝脏组织水肿等相关病理性改变。低剂量NaAsO2染砷组大鼠的肝细胞体积表现为轻微增大，未见明显水肿及出血，肝细胞索排列略有紊乱(图2B)。中剂量NaAsO2染砷组大鼠肝细胞表现为细胞体积进一步增大，可见明显水肿，细胞索排列较为紊乱，细胞间质内均可见明显炎性细胞浸润，并可见明显出血(图2C)。高剂量NaAsO2染砷组大鼠肝细胞表现为编织状排列，水肿较其他模型组明显，肝小叶结构出现异常，细胞索排列明显紊乱，细胞间质内均可见较明显的炎性细胞浸润，肝细胞出现液化坏死情况，并且出血明显(图 2D)。

图2 大鼠肝脏HE染色形态变化Fig.2 HE staining morphology changes in rat liver

2.3 NaAsO2对纹状体SOD活力、GSH和MDA含量的影响

3个不同浓度NaAsO2染砷组与对照组相比，大鼠纹状体组织内SOD活力(图3A)。GSH含量(图3B)均显著下降，MDA含量均显著升高(图3C)，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且随着NaAsO2剂量的增加，大鼠纹状体组织内SOD活力和GSH含量均表现为明显的下降趋势，MDA均表现为明显的上升趋势，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

图 3 NaAsO2对大鼠纹状体组织内超氧化物歧化酶、还原型谷胱甘肽、丙二醛活性的影响Fig.3 NaAsO2for rat corpus striatum tissues、striatum tissues、striatum tissues with the influence of MDA

2.4 NaAsO2对肝脏 SOD活力、GSH和MDA含量的影响

3个不同浓度NaAsO2染砷组与对照组相比，大鼠肝组织内SOD活力(图3A)。GSH含量(图3B)均显著下降，MDA含量均显著升高 (图3C)，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且随着NaAsO2剂量的增加，大鼠肝组织内SOD活力和GSH含量均表现为明显的下降趋势，MDA均表现为明显的上升趋势，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

图 4 NaAsO2对大鼠肝脏组织内超氧化物歧化酶活性、还原型谷胱甘肽活性、还原型谷胱甘肽活性的影响Fig.4 NaAsO2for rat kidney tissues、GSH、with the influence of GSH

3 讨论

在砷中毒的研究领域中，有学者发现砷中毒不仅可导致神经系统发生功能障碍，还可使得砷中毒患者出现相关的神经系统症状［6］。相关形态学研究表明，肢体姿势的调节活动和机体肌张力的维持与纹状体息息相关。而纹状体由大量的神经元细胞组成并作为基底核的最为主要的成分［7］。对于机体而言学习。记忆等高级神经纤维活动的关键脑区是在大脑海马。纹状体与大脑皮质区域。同样砷不仅对大脑部分作用明显，还可导致全身多种器官的损害。例如肝脏，它是机体生物转化运输的枢纽部位，有毒物质作用后必然会对肝脏组织造成一定程度的损伤。

不同的染色方法有益于我们实验研究的观察，而HE染色在临床病理诊断中以及临床疾病治疗过程中是不可或缺的一部分［8］，从大鼠的HE染色切片观察，伴随着NaAsO2染砷剂量的不断增加，机体大脑。肝脏。肾脏毒性损害的作用是随着染砷剂量的增加而增强。本次实验研究结果已经证实，较高剂量砷染毒对大鼠肝脏的损害最为严重，次之为大脑，这可能是与机体个体之间差异以及器官应激差异有关［3］。

由于砷对脑组织产生的损害，我们进行了深入探讨，发现砷可以对脑组织抗氧化系统产生影响，所以这可能是砷中毒对机体大脑纹状体神经元的损害作用机制之一。而神经组织在抗氧化系统失去平衡时的氧自由基主要是产生了脂质过氧化反应，引起了细胞损害，例如细胞缺血缺氧以及中毒等［9］。其次，有相关文献报道，砷可以通过诱导抗氧化酶活性缺陷，升高大脑组织神经元中的脂质过氧化物水平，使得MDA生成增加，而细胞内那些有害的过氧化物代谢产物反而能够被SOD清除，从而保护细胞不受脂质过氧化的损伤，这也证明组织细胞的抗氧化系统功能可以由SOD的活性间接反映。再者，能够使超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶在大脑皮层、纹状体、海马等部位降低的原因除了谷胱甘肽(GSH)含量的降低以及丙二醛 (MDA)含量的增加，还包括脑中存在的自由基介质产生退化变性的因素［10］。其中SOD抗氧化损伤的机制可能是:砷诱导的氧自由基生成增加同时又与SOD结合；过多的自由基不仅造成了过氧化物的增加，也造成SOD和GSH的消耗殆尽［11-12］，因此，在 SOD、GSH、MDA 的活性及含量变化方面表现了剂量-效应关系的依赖性，而在本实验的研究结果中，不同剂量染砷组大鼠纹状体形态变化及SOD活力。GSH含量下降，中。高剂量大鼠染毒组纹状体SOD活力。GSH含量低于低剂量SD大鼠染毒组，结果表明砷可能透过大脑的血脑屏障，在机体脑组织中具有一定程度蓄积，伴随着染砷剂量增加，MDA含量明显高于对照组，这些结果均与以上相关文献报道一致［13］。

Larochette［14］的研究结果表明:由砷诱导的氧自由基ROS的升高可以破坏线粒体的结构以及通透性，通过毒性作用导致细胞出现死亡。Chattopadhyay等［15］学者的研究表明:亚砷酸钠体外作用于孕期的新生大鼠的大脑神经细胞或人胚胎神经细胞，结果均会导致神经细胞产生坏死和凋亡，随着神经细胞内的氧自由基ROS等逐渐升高，SOD活性。GSH水平逐渐降低。亚砷酸盐能够减低细胞内产生的还原型谷胱甘肽GSH的水平，同时抑制谷胱甘肽还原酶的活性，而细胞内氧化还原的平衡需要GSH来维持，二者密不可分，GSH又可以抵御来自氧自由基ROS所产生的一系列氧化损伤［16］。尤其是机体大脑细胞最容易受到氧化应激作用的影响。机体大脑所需的能量大部分由线粒体呼吸链产生的氧化代谢产物供给，并且从作用上来说，抗氧化能力与肝。 肾器官相比较低。同时徐群清等［17］发现:砷中毒后大脑内SOD、GSH水平明显低于阴性对照组，而MDA 水平明显要高于阴性对照组，在本实验的研究结果中，与对照组相比，高剂量NaAsO2染砷组大鼠从形态学观察可见，肝脏组织出现较明显的炎性细胞的浸润，肝细胞出现液化、坏死，出血较为明显，伴随着染砷剂量不断增加，在肝脏组织中的SOD活力。GSH含量明显下降，而MDA含量均有不同程度地增加;不同NaAsO2染砷组大鼠均存在不同程度的肝脏组织损伤，以及肝组织细胞水肿、变性、出血等。实验结果表明导致大鼠肝组织损伤的原因可能是NaAsO2的毒性作用，这些结果均与文献报道一致，均呈现剂量依赖性的关系。

NaAsO2被大鼠摄入体内，直接损伤机体中枢神经系统，同时影响机体的抗氧化系统功能，砷毒性改变了大脑内的神经化学递质传递及细胞凋亡方式，并同时使得肝脏砷毒性损伤增加，肝细胞发生病变，脏器组织功能结构产生障碍和紊乱。严重影响了大鼠体内抗氧化系统的平衡，使SOD活力。GSH含量下降，MDA含量升高，使机体的抗氧化能力减弱。可见氧化应激可能是NaAsO2致大鼠纹状体神经细胞及肝毒性作用的机制之一，并同时为砷中毒发病机制的相关研究提供了切实的研究依据。

［1］李玉飞，康朝胜，臧贵勇,等.NSE在慢性砷中毒大鼠海马CA3 区的表达［J］.神经解剖学杂志，2010(1):93-97.

Li Y F，Kang C S，Zang G Y，et al.NSE expression in chronic arsenic poisoning rat hippocampal CA3 area［J］.Journal of Neuroanatomy Magazine，2010(1):93-97.

［2］王艳萍，姬林松，樊宏伟,等.针刺治疗对地方性氟砷中毒患者肝功能免疫功能的影响 ［J］.辽宁中医杂志，2016(8):1728-1730.

Wang Y P，Ji L S，Fan H W,et al.Acupuncture treatment of liver function in patients with endemic fluorine，arsenic poisoning，the influence of the immune function［J］.Liaoning Traditional Chinese Medicine Journal，2016(8):1728-1730.

［3］曾丹，罗鹏，丁锴,等.亚砷酸钠致大鼠肝功能损伤和肝纤维化形成及其机制探讨［J］.环境与健康杂志，2015(10):859-941.

Zeng D，Luo P，Ding K，et al.Sodium arsenite formation cause liver damage and hepatic fibrosis in rats and its mechanism study ［J］.Journal of Environmental and Healthy Volunteers，2015(10):859-941.

［4］苏菁，李明艳，蒋守芳,等.氟.砷染毒对大鼠脑组织CREB mRNA及蛋白表达的影响 ［J］.环境与职业医学，2013，2(9):707-709.

Su J，Li M Y，Jiang S F，et al.After CREB fluorine，arsenic infected rats had mRNA and protein expression［J］.Journal of environmental and occupational medicine，2013，2(9):707-709.

［5］Barco A R,Brambilla，K.Rosenblum.Neurobiology of Learning and Memory.Editorial ［J］.Neurobiol Learn Mem,2015,(124):1-2.

［6］李玉飞，康朝胜，藏贵勇,等.慢性砷中毒对大鼠海马CA3超微结构的影响［J］.环境与健康杂志，2008，10(6):517-565.

Li Y F，Kang C S，Zang G Y,et al.Chronic arsenic poisoning effect on ultrastructure of rat hippocampal CA3 ［J］.Journal of Environmental and Health Magazine，2008(6):517-565.

［7］K Saga，K Tamai，M Kawachi，et al.Functional modification of Sendai virus by siRNA［J］.Biotechnol，2008,133(3):386-394.

［8］周秀，张爱民，张桂芬,等.肝纤维化四项对各型肝病检测的临床价值［J］.放射免疫学杂志，2008,23(5):424-425.

Zhou X，Zhang A M，Zhang G F,et al.Liver fibrosis，the clinical value of four for various liver disease detection ［J］.Journal of Radiation Immunology Journal，2008，23(5):424-425.

［9］Xu W.Increased oxidative stress is associated with chronic intermittent hypoxia-mediated brain cortical neuronal cell apoptosis in a mouse model of sleep apnea［J］.Neuroscience，2004,126(2):313-23.

［10］Bhadauria S,Flora S J.Response of arsenicinduced oxidative stress，DNA damage，and metal imbalance to combined administration of DMSA and monoisoamyl-DMSA during chronic arsenic poisoning in rats［J］.Cell Biol Toxicol，2007,23(2):91-104.

［11］Lii C K.Oxidative modifications of proteins by sodium arsenite in human umbilical vein endothelial cells［J］.Environ Toxicol，2011,26(5):459-471.

［12］Mittal M,Flora S J.Effects of individual and combined exposure to sodium arsenite and sodium fluoride on tissue oxidative stress，arsenic and fluoride levels in male mice［J］.Chem Biol Interact，2006,162(2):128-139.

［13］Xi S.Distribution and speciation of arsenic by transplacental and early life exposure to inorganic arsenic in offspring rats［J］.Biol Trace Elem Res，2010,134(1):84-97.

［14］N Larochette，D Decaudin，E Jacotot，et al.Arsenite induces apoptosis via a direct effect on the mitochondrial permeability transition pore［J］.Exp Cell Res，1999,249(2):413-421.

［15］S Chattopadhyay，S Bhaumik，M Purkayastha,et al.Apoptosis and necrosis in developing brain cells due to arsenic toxicity and protection with antioxidants［J］.Toxicol Lett，2002,136(1):65-76.

［16］M F Hughes.Arsenic toxicity and potential mechanisms of action［J］.Toxicol Lett，2002,133(1):1-16.

［17］徐群清，梁峰，莫少泽,等.砷中毒对小鼠脑细胞内钙离子浓度影响的研究［J］.微量元素与健康研究，2006(4):8-12.

Xu Q Q，Liang F，Mo Shaoze,et al.Arsenic poisoning in mice brain cells within the research on the effects of calcium ion concentration ［J］.Journal of Trace Elements and Health Research，2006(4):8-12.

Arsenic poisoning induced toxicity and oxidative stress in rat striatum neurons and liver tissues

Qin Wenjuan1，3,Guan Dongfang1,Shi Hongjuan1,Xing Guoqiang2,Li Jiajie1,Ma Rongji1,Lv Hailong2,Jiang Yufeng1*

(1Department of Histology and Embryology,School of Medicine Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832000,China;2 Department of Hepatobiliary Surgery,the First Affiliated Hospital,School of Medicine,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China;3 Departmerot of Ultrasound Diagnosis,the First Affiliated Hospital,Scheol of Medicime of Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China)

To study the effect of NaAsO2(sodium arsenite)poisoning on the striatum neuronal and liver morphology,and the effect of NaAsO2poisoning on neurotoxicity and hepatotoxicity in SD rats.Forty eight 12-week-old SD rats,weighing 200±20 g,were randomly divided into normal control group (free drinking water)and experimental group.The experimental group was subdivided into low dose,medium dose and high dose of NaAsO2group(according to 5、10、20 mg/kg,in the proportion of preparation of distilled water,free drinking).Each group was fed with ordinary feed.12 weeks were needed to construct arsenic models.And then,the rat brain tissue parts were took out for HE staining.Light microscopy was used to observe morphologicalchanges of rat striatum nerve cells and liver tissues.The kits were used to detect striatum and liver tissue superoxide dismutase(superoxide dismutase(SOD)(WST-1 method),reduced glutathione(GSH)(Microplate method)and malondialdehyde(MDA)(TBA method).The HE staining showed that the striatum of NaAsO2group Compared with the control group,the morphology of striatum cells were less regular and the number was sparse and decreased,and the vacuoles were seen in the cytoplasm.The nerve cells of the necrotic edema were observed in the NaAsO2group.The pathological changes of the NaAsO2group were degeneration,necrosis,tissue edema and inflammatory cell infiltration.Compared with the control group,the content of SOD and GSH in the striatum and liver of the rats exposed to NaAsO2decreased obviously(P＜0.05).Compared with the control group,the content of MDA in the striatum and liver of the rats exposed to NaAsO2 increased,and the difference was statistically significant(P＜0.05).The morphological structure of the striatum nerve cells and the damage of the liver tissue structure may be caused by NaAsO2,and the toxic effects of NaAsO2on the striatum and liver tissue of rats may be related to oxidative stress.

NaAsO2poisoning,striatal neurons,liver function,oxidative stress

S793.9

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.03.012

1007-7383(2017)03-0339-05

2017-01-31

自然科学基金项目(81360410)

秦文娟(1990-),女,硕士研究生,专业方向为细胞信号与传导。

*通信作者：姜玉峰(1976-),女,教授,从事细胞信号与传导研究,e-mail:yufengjiang03@126.com。