李鑫，贾李佳，徐路路，王悦，蒋松，王开胜，席继峰，贾斌*

（1石河子大学生命科学学院，新疆 石河子 832003；2石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003）

基于转录组测序的哈萨克绵羊感染包虫病后小肠组织新转录本预测及分析

李鑫，贾李佳1，徐路路1，王悦1，蒋松2，王开胜2，席继峰2，贾斌2*

（1石河子大学生命科学学院，新疆 石河子 832003；2石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003）

前期研究发现具有MHC-DRB1基因单倍型MvaⅠbc-SacⅡab-HinlⅠab的哈萨克绵羊对包虫病具有很强的抵抗能力，但具体机制尚不明确，推测可能与可变剪切形成的小肠组织新转录本具有密切关系，因此，本研究采用PCR-RFLP方法从290只哈萨克绵羊中选择抗病和非抗病个体，分为抗性组（A租）、非抗性组（B组）和空白对照组（C组）。其中A组和B组人工感染包虫病一定时间后，与C组同时宰杀，分别取小肠组织进行Illumina转录组测序，测序结果通过荧光实时定量实验验证后，利用生物信息学方法对各组的新转录本进行预测和分析。结果显示：qRT-PCR验证实验表明转录组测序结果可信度较高，通过生物信息学方法分别从A、B和C组样本中预测出1393、1260、1097个，共计3750个新转录本。转录本所含外显子数与其生物功能多样性具有密切联系，研究发现3个组样品中含有2个以上外显子的新转录本占34.64%（1299个）。研究发现哈萨克绵羊感染包虫病后小肠组织新转录本显著增多，与C组相比A组和B组分别增加了26.98%和 14.86%。KEGG Pathway富集分析结果表明，新转录本所对应的差异表达基因被富集到了自然杀伤细胞介导的细胞毒性通路、细胞色素C-P450介导的外源性化学物质代谢途径和视黄醇代谢途径等代谢通路上。结论：研究发现哈萨克绵羊感染包虫病后，不同MHC-DBR1基因型个体的小肠组织中存在大量新转录本，可能与个体抗病性存在相关性。本研究为探讨哈萨克绵羊分子抗病机制和挖掘遗传育种标记提供了新的思路和理论依据。

哈萨克绵羊；包虫病；小肠组织；Illumina转录组测序；新转录本

棘球蚴病（Echinocossosis）俗称包虫病，是由棘球蚴寄生在人、牛、羊和犬等动物脏器一种人畜共患病［1］。该疾病在全世界范围的广泛流行，新疆是我国主要发病区之一，2014年对新疆十四个地州人畜感染包虫病情况调查显示；绵羊的感染率为10%-70%，造成的经济损失预计约 6亿元左右［2］，对牧民的身体健康和畜牧业的可持续发展构成了严重威胁。目前针对包虫病的主要防治手段是屠宰管理和免疫接种，这些方法具有一定局限性［2］，而近年来快速发展分子生物学技术为阻断包虫病流行提供了新的思路。前期研究中我们发现，哈萨克绵羊的单倍型 MHC-DRB1：MvaⅠbc-SacⅡab-HinlⅠab与包虫病抗性具有相关性，并证明具有该单倍型的哈萨克绵羊对于包虫病具有较强的抵抗力［3］。因细粒棘球绦虫的幼虫-六钩蚴在感染宿主时，首先要通过的第一道物理防线就是小肠粘膜［4］，因此我们推测推测其中存在的免疫分子调控机制与宿主的抗病性具有相关性［5］，但其具体机制尚不清楚。

真核生物中普遍存在可变剪切现象，mRNA前体转录所产生的RNA的外显子以多种方式通过剪切进行重连［6］，由此产生的不同的成熟的 mRNA（即转录本）可能被翻译成不同的蛋白质构体［7］，这种特性不但提高了基因组的使用效率，也成为生物体获得新基因功能的重要途径，被认为是造成蛋白亚型间功能差异的主要原因［8］。有研究表明，同一基因的不同转录本可能与疾病发生，以及个体的抗病性和易感性存在密切联系［9］，例如骨桥蛋白不同转录本分别具有促进和抑制乳腺癌和前列腺癌细胞的作用［10］，DDAHI基因2种不同的转录本的表达水平以及编码的DDAH1蛋白在ADMA的代谢中的作用及相互关系可能是心血管疾病的分子机制之一［11］。因此，对新转录本预测与功能分析已逐渐成为分子免疫学和临床医学等学科的研究热点。然而，目前针对哈萨克绵羊的新转录本与抗病能力相关性的研究未见报道。

转录组技术的对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，是连接基因组遗传信息与蛋白组生物功能的纽带，也是基因功能及结构研究的基础和出发点［12］。通过高通量转录组测序结合生物信息学分析方法，可能获得大量新转录本［13］。结合前期研究，我们推测不同MHC基因型哈萨克绵羊感染包虫病后，小肠组织中可能存在大量未知转录本，与个体的包虫病抗性和易感性具有密切联系。本研究选择抗病和非抗病的绵羊分为实验组和对照组，人工感染包虫病后采集小肠组织并进行Illumina高通量转录组测序，对结果进行生物信息学分析并预测各组出现的新转录本，从而为挖掘新的分子标记和抗病育种工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

与前期研究［14］的材料相同，选择新疆兵团第九师165团哈萨克绵羊中心产区同一羊场，在相同饲养条件和环境中饲养、体重相近的290只哈萨克绵羊。

绵羊包虫病ELISA试剂盒购自深圳康百得生物科技有限公司。DNA Marker、Taq酶和限制性内切酶MvaⅠ、SacⅡ、Hin1Ⅰ、HaeⅢ等购自宝生物（大连）有限公司；蛋白酶K购自Sigma公司，其余常规试剂均为市售分析纯。

1.2 方法

1.2.1 不同MHC基因型哈萨克绵羊感染包虫病后小肠组织分离

290只哈萨克绵羊戴上耳号，颈静脉采血样，加入抗凝剂后提取基因组DNA，设计引物PCR扩增MHC-DBR1基因第二外显子，PCR产物分别用MvaⅠ、SacⅡ、Hin1Ⅰ内切酶切割，酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，进行MHC-DRB1：MvaⅠbc-SacⅡab-HinlⅠab抗包虫病单倍型分析；根据基因分型返回羊场选择具有抗性基因型的哈萨克绵羊3只作为实验组（KSP-AI，A组），非抗性基因型的绵羊4只，3只作为对照组（KSN-AI，B组），1只作为空白对照组（KSN-UAI，C组），经ELISA免疫试剂盒确认未感染包虫病，购买并饲养于石河子大学动物科技学院实验动物养殖场，预试验1周后进行人工攻虫试验。

从驱虫后人工感染包虫病犬的小肠上段收集细粒棘球绦虫孕卵节片，破碎后收获虫卵。模拟绵羊自然感染包虫病过程，进行细粒棘球绦虫虫卵人工口服同时感染实验组和对照组全部6只绵羊，每只绵羊口服孕卵节片20个(虫卵8000-12000枚，前期研究已经证明人工感染成功)，攻虫后分别于6、8、10 h各宰杀1只实验组和对照组绵羊，6 h宰杀未攻虫的空白对照组绵羊，并在最短时间内采集绵羊小肠组织(包括十二指肠、空肠前部、空肠中部、空肠后部和回肠)，将试验组的所有组织样本混合后液氮冻存，对照组和空白对照组采用同样方法处理［14］。

1.2.2 Illumina Solexa测序及分析

将液氮保存的样品送至华大基因进行Illumina测序，对原始数据进行去除接头、污染序列及低质量reads的处理，并进行以下生物信息学分析：

1.2.2.1 转录组测序实验步骤

提取样品总RNA并使用DNase I消化DNA后均分为2份，其中一份用于转录组测序：用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；加入打断试剂在 Thermomixer中适温将mRNA打断成短片段，以打断后的mRNA为模板合成一链cDNA，然后配制二链合成反应体系合成二链cDNA，并使用试 剂盒纯化回收、粘性末端修复、cDNA的3’末端加上碱基“A”并连接接头，然后进行片段大小选择，最后进行PCR扩增；构建好的文库用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System质检合格后，使用Illumina HiSeqTM 2000测序仪进行测序。

1.2.2.2 测序数据质控及新转录本预测分析

由Illumina HiSeqTM2000测序所得的数据，通过软件除去接头序列（adapter）和含大量低质量碱基的reads后转化为clean reads，首先对其进行测序结果碱基组成和质量评估，然后使用比对软件SOAP aligner/SOAP2将3个样品的clean reads分别与参考基因组（http://www.livestockgenomics.csiro.au/sheep/oar3.1.php/）中可信度高的转录本进行比对，将满足以下条件的转录本定义为新转录本：测序长度不短于180 bp；测序深度不小于2；数据库中的同源转录本不小于200 bp；测序转录本在数据库中未注释。

1.2.2.3 新转录本对应差异表达基因的K EG G Pathw ay显著性富集分析

对筛选出的新转录本所对应的3个组间差异表达编码基因分别进行Pathway分析。

编码新转录本的基因使用RPKM法 (Reads per kilobase transcriptome per million mapped reads)［15］计算其表达量。随后参照Samarski等［16］报道的方法筛选各组间差异表达基因，并通过控制FDR（False Discovery Rate）来决定p-value的域值。本研究中将差异表达基因定义为FDR≤0.001且倍数差异在2倍以上的基因［17］。随后，将这些基因与KEGG数据库进行比对，以分析其潜在的功能和与个体抗病能力的相关性。

2 结果与分析

2.1 测序质量评估

2.1.1 测序结果碱基组成和质量评估

通过分析碱基的组成和质量值分布可以控制原始数据的质量。3个样品的碱基组成情况结果如图1、图2和图3所示。X轴上，1-90bp代表read1的碱基位置，91-180 bp代表read2的碱基位置。碱基组成平衡的情况下，A、T曲线基本重合，G、C曲线基本重合。

3个样品测序reads的碱基质量分布情况如图4、图5和图6所示。整体上看，低质量(＜20)的碱基比例较低，说明各个样品的测序质量比较好，符合预测新转录本的生物信息学分析要求。

图1 A组样品碱基组成情况Fig.1 Base composition analysis of sample A

图2 B组样品碱基组成情况Fig.2 Base composition analysis of sample B

图3 C组样品碱基组成情况Fig.3 Base composition analysis of sample C

图4 A组样品碱基质量情况Fig.4 Base sequence quality of sample A

图5 B组样品碱基质量情况Fig.5 Base sequence quality of sample B

图6 C组样品碱基质量情况Fig.6 Base sequence quality of sample C

2.1.2 测序结果的荧光实时定量验证

为验证转录组测序结果的可靠性，从测序结果中随机抽取5个基因，通过Primer 5.0软件设计引物，以GAPDH管家基因为内参，通过荧光实时定量方法进行检测。各基因引物序列和退火温度见表1。

荧光实时定量实验结果表明：各基因在样品组间的差异表达倍数与转录组测序结果相比，虽然数值略有差异，但总体变化趋势一致（图7），证明转录组测序结果真实可信。

表1 荧光定量检测引物Tab.1 Primers for real-time PCR validation

图7 随机挑选5个基因的荧光实时定量验证结果Fig.7 Validation of Illumina sequencing data by q-PCR on 5 randomly selected genes

2.2 新转录本预测结果

通过 Reads的分布以及参考基因的注释集合，本研究在参考基因组上预测出了大量新转录本（Novel Transcript Unit，Novel TU）。以 A 组为例，部分新转录本的预测结果见表2，各列含义分别为：Novel_TU_ID：新转录本 ID；Chromosome：所属染色体；+/-：新转录本所在染色体的正负链信息；Blocks：新转录本外显子数目；Sizes：新转录本每个外显子大小，以逗号分隔；Starts：每个外显子起始位点在染色体上的位置，以逗号分隔。

表2 A组部分新转录本预测结果Tab.2 Part of novel transcript prediction in group A

3个样品组共计预测出3750个新转录本。其中A组有1393个，B组1260个，C组1097个，各组新转录本分布位置（正/负链）和包含外显子如表3所示。

表3 3个样本的新转录本预测结果统计Tab.3 Statistic table of novel transcripts

为研究新转录本功能，首先需要判断某个转录本是否能够编码蛋白质。本研究运用Coding Potential Calculator(CPC:http://cpc.cbi.pku.edu.cn/)对新转录本的编码能力进行预测。将其分为编码（Coding）和非编码（noCoding）两类，统计结果见图 8。

图8 3个样本新转录本数量统计图Fig.8 Statistic chart of novel transcripts

全部3750个新转录本中，含有2个外显子的新转录本比例为53.89%（2021个），含有2个以上外显子的新转录本比例为34.64%（1299个，图9，其中横坐标代表含有单个新转录本含有外显子个数，纵坐标代表含有相应外显子的新转录本个数）。哈萨克绵羊感染包虫病后小肠组织新转录本显著增多，与空白对照组相比抗性组和非抗性组分别增加了26.98%和14.86%。

图9 各组新转录本含有外显子数量分布图Fig.9 Exon counts in novel transcripts

各组新转录本在染色体上的分布情况如图10所示，其中横坐标的C1-C26代表1-26对常染色体，SC代表性染色体（sex chromosome），Sca代表测序分析过程中由contigs组成的scaffold片段。纵坐标为染色体对上相应含有的新转录本数量。

图10 各组新转录本在绵羊染色体上的分布情况Fig.10 Density distribution of novel transcripts in sheep chromosome

2.3 新转录本的KEGG分析统计

以上实验中预测出的新转录本所对应的原始基因为目标，通过RPKM法选择其中FDR≤0.001且倍数差异在2倍以上的差异表达基因，进行KEGG Pathway分析，并从各组中选择富集基因数量最多的5个代谢通路，结果如表4所示。

表4 新转录本的KEGG分析统计结果Tab.4 The statistical analysis results of the novel transcripts

3 讨论

1）为了保证转录组测序质量，在信息分析前需要对对测序基本读取单元（reads）的碱基组成和碱基质量进行综合评定。本研究的结果表明，3个组样品的测序片段质量较高，符合后期生物信息学的要求。此外，为了验证测序结果的可信度，本研究随机挑选了5个差异表达基因，以GAPDH基因为参照，通过qRT-PCR实验进行验证，结果表明，各基因在3个组中的差异表达情况与转录组测序结果基本一致，测序可信度较高。

2）本研究的生物信息学分析发现，哈萨克绵羊在感染包虫病前后，小肠组织中的新转录本数量存在较大差异：与空白对照组C组相比，人工感染的A组和B组所含新转录本数量分别提高了27.68%和14.86%。而均经过人工感染的A组与B组之间新转录本数量也存在差异（133个，10.56%）。由于小肠组织是细粒棘球蚴感染宿主的主要防线，而3个样品组的绵羊个体又属于同一物种，基因序列具有高度同源性，因此我们推测，哈萨克绵羊小肠组织中同一基因的不同新转录本可能与个体的抗包虫病性存在密切联系。对这些转录本进行蛋白质编码分析发现，小部分预测出的新转录本都能翻译为蛋白质，其中存在的功能多样性也值得进一步深入挖掘。

3）本研究发现，各组中此类上新转录本数量分别为 509、378和 412，合计 1299个，占总数的34.64%。一般认为，新转录本所含外显子越多，则构成该转录本的剪切方式和对应编码基因的潜在生物功能多样性也就越复杂［18］，这可能与个体的抗病和易感相关性状密切相关，因此本研究结果中包含3个及以上外显子的转录本具有重要的研究价值［19］。

4）本研究的KEGG Pathway分析发现，各组间新转录本所对应的差异表达基因（FDR≤0.001）富集到多条代谢通路，其中部分通路可能与绵羊个体抗病性差异相关，部分通路如下：

（1）视黄醇代谢途径（Retinol metabolism）。

通常认为，视黄醇（即维生素A）在人和动物体内具有维持正常视觉功能、维持骨骼正常生长发育、促进生长与生殖和抑制肿瘤等功能［20］。近年来，有研究表明，寄生虫夺取素质体内维生素A导致免疫系统产生相对的正向适应机制［21］。本研究发现，部分具有新转录本的差异表达基因被富集到了视黄醇代谢途径，且这些基因在A组的表达量高于B组，推测这种高表达可能引起宿主寄生虫的强抵抗作用，是哈萨克绵羊抗包虫病的潜在机制之一。

（2）自然杀伤细胞介导的细胞毒性（Natural killer cell mediated cytotoxicity）。

本研究发现，部分新转录本对应的A组和B组间差异表达基因被富集到了NK细胞介导的细胞毒性通路，推测这些基因在不同绵羊中的表达水平可能与个体抗病性相关。自然杀伤细胞是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。有报道表明：NK细胞的天然杀伤力（即细胞毒性）越强，则消灭病原体的效率越高［22］，而同一种属不同个体的NK细胞毒性具有较大差异，其原因可能是个体基因型导致的细胞表面信号识别和关键效价分子结合能力差异［23］，造成不同个体对特定疾病表现出不同的抗性和易感性［24］。但目前未见与绵羊抗包虫病的相关报道。

（3）细胞色素C-P450介导的外源性化学物质代谢途径。

细胞色素是一类以铁卟啉（或血红素）作为辅基的电子传递蛋白，广泛参与动、植物，酵母以及好氧菌、厌氧光合菌等的氧化还原反应。病原体可能会激发宿主体内的细胞色素相关代谢途径从而营造有利的生存环境［25,26］或增强其耐药性［27-28］。本研究发现，新转录本对应的部分差异基因被富集到了细胞色素C-P450介导的代谢通路，推测这些基因可能会影响细粒棘球蚴对绵羊的感染效率，从而表现出不同个体的抗病性差异。相关基因的具体功能和机制有待进一步挖掘。

4 结论

本研究通过转录组测序，在三个样本组哈萨克绵羊的小肠组织中共计预测出3750个新转录本，为完善绵羊的遗传信息和深入挖掘抗病育种标记奠定了基础，qRT-PCR验证实验结果表明转录组测序结果可信度较高，能满足进一步研究需要。

在本研究中，34.64%的新转录本含有2个以上的外显子，且哈萨克绵羊感染包虫病后小肠组织新转录本显著增多，与空白对照组相比抗性组和非抗性组分别增加了26.98%和 14.86%。KEGG Pathway分析表明，实验组与对照组间含有新转录本的差异表达基因被富集到了自然杀伤细胞介导的细胞毒性、细胞色素C-P450介导的外源性化学物质代谢途径和视黄醇代谢途径等通路中，已有研究表明这些代谢通路与宿主抗寄生虫感染分子调控机制有关，但相关的新转录本的功能还有待进一步挖掘与验证。

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Prediction and analysis of novel transcripts based on RNA-seq of Kazakh Sheep infected by Echinococcosis

Li Xin1,Jia Lijia1,Xu Lulu1,Wang Yue1,Jiang Song2,Wang Kaisheng2,Xi Jifeng,Jia Bin2*
(1 College of Life Science,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China;2 College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi，Xinjiang 832003,China)

It has been proved that the Kazakh sheep with MHC-DRB1 haplotype,MvaIbc-SacIIab-Hin1Iab, had a strong resistance onCystic ehinococcosis(CE).However,the mechanism is still unclear.It is supposed that disease resistance is closely allied to novel transcripts result from alternative splicing in small intestine tissues.So the PCR-RFLP were employed to select the disease resistant and non-resistant Kazakh sheep.Sheep were grouped as follows:group A,The sheep with the MHC-DRB1 MvaIbc-SacIIab-Hin1Iab haplotype (CE resistant haplotype);group B,sheep without this haplotype;group C,sheep choose as healthy controls.CE model was established in group A and B.Then intestine tissues of the three groups were collected and examined by Illumina RNA-Seq.After validation of qRT-PCR,the sequence data were predicated and analyzed by bioinformatics.The result showed that the qRT-PCR experiment indicate reliability of RNA-seq.1393,1260 and 1097 novel transcripts were predicated from each group.It was found that the transcripts containing more than two exons occupy 34.64%of 1299.It showed that infection might cause definite augments of novel transcripts,for 27.68%in group A and 14.86%in group B,compared with group C.The KEGG pathway analysis showed that the differentially expressed genes corresponding to novel transcripts wereenriched in pathways like natural killer cell mediated cytotoxicity,metabolism of xenobiotics by cytochrome P450 and retinol metabolism.It is concluded that the massive novel transcripts are found in Kazakh Sheep with different MHC haplotype after infection,and they may be closely related to disease resistance.This research could provide evidence for further study of molecular level mechanism of disease resistance.

Kazakh Sheep;Cystic echinococcosis;small intestine tisssues;illumina RNA-seq;novel transcripts

S826；S858.26；S855.9

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.03.010

1007-7383(2017)03-0326-08

2016-06-24

国家自然科学基金项目（31260535）；石河子大学大学优秀青年科技培育计划项目（2013ZRKXYQ13）；石河子大学动植物育种专项（XJS2013-YZ09）

李鑫（1983-），男，讲师，博士研究生，专业为生物化学和分子生物学，e-mail：lixin2032433@163.com。

*通信作者：贾斌(1965-)，男，教授，博士生导师，从事动物遗传育种与繁殖研究，e-mail：jiabin@shzu.edu.cn。