张荣强，刘启玲，孙 娜，康武林，袁普卫

陕西中医药大学 1公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室 2第一临床医学院骨科，陕西咸阳 712046



·论 著·

人类免疫缺陷病毒合并结核杆菌感染者外周血差异表达基因的生物信息学分析

张荣强1，刘启玲1，孙 娜1，康武林2，袁普卫2

陕西中医药大学1公共卫生学院流行病与卫生统计学教研室2第一临床医学院骨科，陕西咸阳 712046

目的 分析人类免疫缺陷病毒(HIV)/结核杆菌(TB)感染者外周血基因的生物学网络调控机制及关键蛋白，为HIV/TB感染者的早期诊断和临床治疗提供新依据。方法 从基因芯片公共数据库GEO中下载了22例南非HIV感染者和22例HIV/TB感染者的外周血基因芯片数据，将数据导入分析软件QOE、STRING、PANTHER、GenClip等，分析两组患者的基因表达谱、蛋白相互作用网络、分子生物学过程、基因功能等，寻找区别两类患者的关键节点基因。结果 两组患者15 529个基因的表达谱相似，44名受试者的基因表达谱具有高度关联性；251个(1.62%)差异表达基因对诊断HIV/TB感染具有良好的诊断能力；RPLP1是蛋白-蛋白相互作用图谱子网络的核心节点；差异表达基因与正向调节外界刺激、细胞内信号通路的转导、中性粒细胞的迁移、人体免疫等有关，主要参与自由基相关凋亡、炎性反应等通路的活化。结论 共发现251个差异表达的基因可将单纯HIV感染和HIV/TB感染进行区别，其中差异表达的前40个基因的蛋白-蛋白相互作用网络中所包含的RPLP1基因可能与HIV/TB感染密切关联，主要涉及正向调节外界刺激、细胞内信号通路的转导、中性粒细胞的迁移、人体免疫等生物学功能，为HIV/TB感染的诊断和治疗提供了一定的参考依据。

人类免疫缺陷病毒；结核杆菌；差异表达基因；生物信息学

ActaAcadMedSin，2017,39(3)：336-344

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染引起的一种传染病，可严重破坏人体免疫系统，病死率较高[1]。结核病是由结核杆菌(tubercle bacilli，TB)感染引起的一种慢性传染病，主要侵犯肺脏，病死率较高。这两种传染病的早期诊断对积极采取合理的治疗方案具有重要意义[2]。然而，在现阶段医疗技术的条件下，HIV感染者感染TB的早期诊断具有极大挑战性。近年来，基因组学技术取得了巨大进展，为TB感染尤其是HIV合并TB感染(HIV/TB)的诊断提供了重要参考依据[3- 7]。酸性核糖体磷酸蛋白P1基因(acidic ribosomal phosphoprotein P1，RPLP1)是酸性核糖体磷酸化蛋白基因家族成员之一，在生物体内如果发生了磷酸化，酸性核糖体磷酸化蛋白才能够发挥相应的生物学活性，如：参与蛋白质合成、细胞凋亡等过程，且与肿瘤、免疫疾病(系统性红斑狼疮等)有一定关联[8]。本研究对基因芯片公共数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)收录的一组HIV和HIV/TB感染者外周血差异表达的基因芯片数据资料进行生物信息学分析，深入探讨了HIV/TB感染者外周血分子网络改变情况及其可能涉及的分子生物学功能，以期进一步了解RPLP1与HIV可能存在的生物学关联，帮助临床预防、早期诊断和治疗HIV/TB感染。

资料和方法

资料来源 以“HIV”为检索词在PubMed的GEO数据库中进行检索，获得Dawany N和 Showe LC等于2014年6月提交的GSE50834基因芯片数据。GSE50834数据是采用Illumina公司提供的人类HumanHT- 12 V4.0基因表达芯片平台GPL10558检测获得。基因芯片数据来自于南非一个人群队列(HIV感染者22例，HIV/TB感染者22例)的外周血单核细胞RNA标本。GSE50834数据集共包含了15 529个基因的表达资料。

两组患者基因表达谱系分析 Qlucore Omics Explorer 3.1(QOE)是一种新型的生物信息分析软件系统，能够实现全面、迅速地针对基因表达、高通量基因芯片、实时定量PCR(RT-PCR)及DNA甲基化等多种原始生物学数据库进行分析。本研究将数据集GSE50834导入到QOE软件，对数据集GSE50834中的基因芯片数据进行(均数=0，标准差=1)标准化处理；通过(P<0.01，q<0.01)过滤后行两独立样本t检验，筛选出单纯HIV感染者与HIV/TB感染者的差异表达基因，然后对数据集GSE50834中的基因芯片数据行主成分分析及分层聚类分析。

差异表达基因的蛋白-蛋白相互作用图谱分析 将HIV感染者和HIV/TB感染者差异表达的前40个基因相应的蛋白名称上传至STRING 9.05蛋白-蛋白相互作用在线分析软件，根据具体分析结果适当调节可信度和附加节点参数，绘制两组差异表达基因的蛋白-蛋白相互作用图谱。

差异表达基因的GO功能富集、信号通路分析和文献挖掘 将前40个明显差异基因列表上传至人类基因功能和网络分析软件GenCliP 2.0，根据需要调节各类分析的主要参数，分析两组患者差异表达基因的GO功能富集状况与涉及的信号通路，并检索“艾滋病”和“肺结核”进行文献挖掘。

结 果

HIV/TB感染者与单纯HIV感染者基因表达谱分析 两组患者基因表达状况如图1所示，两组患者的基因表达谱基本相似；将44名受试者的基因表达数据导入QOE软件行相关性分析，结果表明HIV感染者与HIV/TB感染者的基因表达谱高度关联，提示本研究所采用的数据集数据稳定(图2)。

HIV：人类免疫缺陷病毒；TB：结核杆菌

HIV：human immunodeficiency virus；TB：tubercle bacilli

图 1 HIV/TB感染者与单纯HIV感染者基因表达状况

Fig 1 Gene expression profiles in HIV/TB co-infected patients and HIV-infected patients

图 2 受试个体基因表达图谱相关性分析

Fig 2 Correlation analysis of gene expression profiles of subjects

两组患者基因表达模式比较 对两组患者基因表达主成分的分析结果显示，根据两组患者的基因表达模式可以将单纯HIV感染和HIV/TB感染的患者很好的区别开，X轴、Y轴、Z轴的数据方差贡献率分别为10%、7%、30%(图3A)，在Z轴方向上单纯HIV感染和HIV/TB感染的患者表达差异最明显。两组患者15 529个基因表达PCA图显示：单纯HIV感染与HIV/TB感染状况可能会影响患者外周血基因组的表达模式(图3B)。

差异表达基因对HIV/TB感染者的诊断能力 QOE软件对原始数据进行标准化处理后，采用两独立样本的t检验，共发现251个(1.62%)差异表达基因(P<0.05)；差异表达基因的聚类热图显示，251个差异表达基因对诊断HIV/TB感染具有良好的诊断能力(图4)。

A.各受试对象的基因表达主成分分析图；B.各受试基因的表达主成分分析图

A. principal components analysis pattern of gene expression from tested subjects；B. principal components analysis pattern of gene expression from tested genes

图 3 HIV/TB感染者与单纯HIV感染者基因表达模式比较

Fig 3 Comparison of gene expression patterns between HIV/TB co-infected patients and HIV-infected patients

图 4 251个差异表达基因的聚类热图

Fig 4 Clustering heat maps of 251 differentially expressed genes

差异表达基因的蛋白-蛋白相互作用结果 本研究选择差异表达的前40个基因进行蛋白-蛋白相互作用图谱分析，其中HIV/TB感染者表达下调的基因有19个(45.00%)，表达上调的有21个(55.00%)。将前40个基因相对应的蛋白名称导入STRING 9.05软件分析蛋白-蛋白相互作用网络，结果显示拓扑网络中包含1个最典型的子网络，主要与蛋白质的合成等生物学功能有关。其中，RPLP1与网络中的其他≥10个蛋白存在相互作用关系，删除该节点后，网络结构涣散，可以认为RPLP1是子网络的核心节点，同时提示RPLP1可能对区别两类患者具有一定的价值(图5)。

差异表达基因涉及的GO功能富集分析 采用GenClip在线软件分析两组患者前40个差异表达基因的GO功能富集状况，结果显示17个基因(42.50%)(CST3、GPX1、GRN、DBNL、LCP1、LGALS1、MYL6、ATP6AP1、CPVL、PSAP、PTMA、RPLP1、S100A9、S100A10、TALDO1、WARS、GSTO1)与外细胞器、细胞囊的形成等有关；12个基因(30.00%)(CCBE1、GPR183、FCER1G、GPX1、DBNL、CXCL8、LGALS1、ATP6AP1、PPBP、PSAP、S100A9、GSTO1)与正向调节外界刺激有关；5个基因(12.50%)(GPR183、FCER1G、LCP1、LGALS1、PPBP)主要与细胞内信号通路的转导有关；4个基因(10.00%)(FCER1G、CXCL8、PPBP、S100A9)主要与中性粒细胞的迁移有关；3个基因(7.50%)(FCER1G、CXCL8、PPBP)主要与白细胞介导的人体免疫有关。≥3个基因具有相同生物学功能的聚类分析见图6。

图 5 差异表达基因的蛋白—蛋白相互作用网络图

Fig 5 Network of protein-protein interactions for differentially expressed genes

图 6 差异表达基因涉及的生物学功能的GO功能富集分析

Fig 6 GO function enrichment analysis of the biological functions of differentially expressed genes

差异表达基因涉及的通路分析 两组患者前40个差异表达基因主要涉及自由基相关凋亡通路、炎性反应通路、哮喘通路、胱甘肽代谢通路、幽门螺杆菌感染上皮细胞信号通路、血小板活化状态通路、血小板栓子形成通路、血小板脱粒通路、趋化因子受体通路、肽配体结合受体通路、溶酶体通路、止血通路等12条通路，≥3个基因涉及相同信号通路的聚类分析见图7。

图 7 差异表达基因涉及的信号通路分析

Fig 7 Analysis of signaling pathways of differentially expressed genes

差异表达基因的文献挖掘 利用GenClip检索包含指定的40个基因及“艾滋病”和“结核病”的文献，并进行聚类分析，结果显示，指定的40个基因中，CEBPP、DBNL、CST3、CXCL8、PPBP、S100A9、WARS、GPx1、GRN、HLA-DRA等基因与“艾滋病”和“结核病”的阳性报道较多，提示这几个基因可能与两种疾病关联较密切，其主要涉及DNA合成、细胞凋亡与激活、免疫功能、炎性反应等生物学过程；而RPLP1基因主要参与免疫应答与细胞死亡等通路，(图8)。

讨 论

结核病是HIV感染者(含艾滋病患者)最常见的合并感染的传染病，也是该类患者常见的死亡原因。HIV和TB可以在患者机体内发生交互作用，对患者产生重要影响，表现为：患者可以迅速发展为活动性结核患者；由于患者的免疫系统破坏，再次感染TB的机会增多；明确诊断越来越难。流行病学研究结果表明，HIV是促进TB流行的动力因子，TB是艾滋病患者最常见的机会性感染[9- 12]。目前，艾滋病在全球流行，HIV/TB感染成为日益突出的问题，特别是在非洲地区，HIV/TB的预防、诊断和治疗已引起越来越多的医务人员关注。

临床上，HIV/TB感染的诊断主要依靠临床综合诊断，但存在很大困难。细菌培养是包括HIV/TB感染在内的结核病诊断的“金标准”，但检测时间长，阳性率偏低。近年来，分子生物学诊断技术有了很大发展，但在实际临床工作中，该类诊断所需要的仪器设备、技术能力、试剂耗材等要求较高，无法在实际工作中广泛推广。因此，HIV/TB感染的明确诊断还需要进一步深入研究，寻找诊断可靠、可在各类医院广泛推广的诊断技术是广大医务工作者的共同心愿。伴随着基因组学研究方法的发展，在HIV/TB感染研究领域也有了许多研究结果和数据资料。采用生物信息学技术对这些数据资料进行深入挖掘，可能对HIV/TB感染的早期诊断具有重要的临床价值[13- 15]。

本研究采用分子生物学技术对一组来自非洲队列的HIV感染(n=22)和HIV/TB感染(n=22)的患者基因芯片检测数据进行了细致挖掘。基因谱结果提示：两组患者15 529个基因表达模式具有高度的一致性，这可能是HIV/TB感染者较难确诊的遗传基础，同时提示对两组基因的表达资料进行更深层次的挖掘是有必要的。采用QOE在线分析软件进行两组患者基因表达模式的主成分分析结果显示：两组患者的基因表达模式实际上有明显差别，共发现251个差异表达的基因，且可以将单纯HIV感染和HIV/TB感染者很好地区别开，究其原因可能是HIV合并感染TB病菌后，患者的免疫系统呈抑制状态，从而影响某些重要基因的合成或蛋白质降解的关键环节，进而影响DNA的表达水平[16- 18]。两组差异表达的前40个基因的蛋白-蛋白相互作用网络中包含1个最典型的子网络，主要参与蛋白质的合成，RPLP1是子网络的核心节点，提示RPLP1可能对区别两类患者具有一定的临床价值。Zampieri等[19]研究发现，RPLP1蛋白依赖Caspase完成脱磷酸化，然后暴露于自身免疫系统之下从而导致自身免疫反应，这可能是系统红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)发病的始动因子。艾滋病的发病机制目前尚不清楚，但其与SLE患者的免疫功能会发生相似改变，如T细胞异常等。目前已有证据表明HIV病毒可以诱发艾滋病和SLE等自身免疫性疾病。上述研究结果表明：RPLP1基因完成脱磷酸化后可能在HIV逆转录病毒诱发SLE、艾滋病等自身免疫性疾病的过程中发挥着一定的作用，但需进一步深入探讨[20]；RPLP1基因与肺结核的关系目前尚未见报道，综合本研究的分析结果提示：RPLP1基因可能与HIV合并感染TB病菌有密切关联。

图 8 差异表达基因与文献报道结果相关性分析

Fig 8 Correlation analysis between differentially expressed genes and reported results

基因的生物学功能分析结果显示：两组差异表达的前40个基因主要参与细胞器的形成、信号通路的转导、免疫系统的保护等生物学过程；主要涉及自由基相关凋亡通路、炎性反应通路等信号通路。提示HIV合并感染TB病菌后，机体的遗传调控网络中的关键因子激活了凋亡相关信号通路、炎症相关信号通路等，影响了机体的信号转导能力、免疫系统状态等，呈现出不同的临床症状同时影响预后[20- 21]。通过文献挖掘，本研究的分析结果大部分可以在目前已发表的文献中找到相似的证据。

综上，本研究采用生物信息学研究方法对南非22例HIV感染者和22例HIV/TB感染者外周血单核细胞的15 529个基因表达的基因芯片数据分析结果显示，共发现251个差异表达的基因可将单纯HIV感染和HIV/TB感染者进行区别，其中差异表达的前40个基因的蛋白-蛋白相互作用网络中所包含的RPLP1基因可能与HIV合并感染TB有密切关联；两组差异基因主要参与细胞凋亡和炎症相关信号转导通路，这为HIV合并TB感染的早期诊断提供了一定的科学依据。在进一步研究时，应加入正常人群的外周血细胞基因表达谱数据，再进行细致的生物信息学分析，可能会得到更为全面详尽的分析结果。

[1]Apidechkul T. A 20-year retrospective cohort study of TB infection among the Hill-tribe HIV/AIDS populations，Thailand[J]. BMC Infect Dis，2016，16：72.doi:10.1186/s12879-016-1407- 4.

[2]Kassa D，de Jager W，Gebremichael G，et al. The effect of HIV coinfection，HAART and TB treatment on cytokine/chemokine responses to mycobacterium tuberculosis(Mtb)antigens in active TB patients and latently Mtb infected individuals[J]. Tuberculosis(Edinb)，2016，96：131- 140.

[3]Lawn SD，Kerkhoff AD. Rapid diagnosis of TB in HIV-positive in-patients with M. tuberculosis bacteraemia in sub-Saharan Africa[J]. Int J Tuberc Lung Dis，2015，19(12)：1557- 1559.

[4]Anwar MN. Childhood TB in HIV ERA-in sub saharan africa[J]. Intensive Care Med Exp，2015，3(Suppl 1)：A346.

[5]Montales MT，Chaudhury A，Beebe A，et al. HIV-associated TB syndemic：a growing clinical challenge worldwide[J]. Front Public Health，2015，3：281.

[6]Efsen AM，Schultze A，Post F A，et al. Major challenges in clinical management of TB/HIV coinfected patients in Eastern Europe compared with Western Europe and Latin America[J]. PLoS One，2015，10(12)：e145380. doi：10.1371/journal. pone.0145380.eCollection 2015.

[7]Ndagijimana A，Rugigana E，Uwizeye CB，et al. One-stop TB-HIV services evaluation in Rwanda：comparison of the 2001- 2005 and 2006- 2010 cohorts[J]. Public Health Action，2015，5(4)：209- 213.

[8]吴海燕，唐圣松. 酸性核糖体磷酸化蛋白P(0- 2)的研究进展[J]. 南华大学学报：医学版，2006，34(5)：634- 636.

[9]Skogmar S，Schon T，Balcha TT，et al. Plasma levels of neopterin and C-reactive protein(CRP)in tuberculosis(TB)with and without HIV coinfection in relation to CD4 cell count[J]. PLoS One，2015，10(12)：e144292. doi：10.1371/journal.pone. 0144292.eCollection 2015.

[10]D’Elia A，Evans D，McNamara L，et al. Predictive and prognostic properties of TB-LAM among HIV-positive patients initiating ART in Johannesburg，South Africa[J]. Pan Afr Med J，2015，22：4. doi：10.11604/pamj.2015.22.4.6075.

[11]Barnett B，Gokhale RH，Krysiak R，et al. Prevalence of drug resistant TB among outpatients at an HIV/TB clinic in Lilongwe，Malawi[J]. Trans R Soc Trop Med Hyg，2015，109(12)：763- 768.

[12]Belay M，Bjune G，Abebe F. Prevalence of tuberculosis，HIV，and TB-HIV co-infection among pulmonary tuberculosis suspects in a predominantly pastoralist area，northeast Ethiopia[J]. Glob Health Action，2015，8(1)：27949.

[13]Ford N，Getahun H. Service integration to reduce HIV-associated TB mortality[J]. Public Health Action，2015，5(4)：204.

[14]Mekonnen D，Derbie A，Desalegn E. TB/HIV co-infections and associated factors among patients on directly observed treatment short course in Northeastern Ethiopia：a 4 years retrospective study[J]. BMC Res Notes，2015，8：666.doi:10.1186/s13104-015-1664- 0.

[15]Nglazi MD，Bekker LG，Wood R，et al. The impact of HIV status and antiretroviral treatment on TB treatment outcomes of new tuberculosis patients attending co- located TB and ART services in South Africa：a retrospective cohort study[J]. BMC Infect Dis，2015，15：536.doi:10.1186/s12879- 015-1275-3.

[16]Thi AM，Shewade HD，Kyaw NT，et al. Timing of antiretroviral therapy and TB treatment outcomes in patients with TB-HIV in Myanmar[J]. Public Health Action，2016，6(2)：111- 117.

[17]Gray JM，Cohn DL. Tuberculosis and HIV coinfection[J]. Semin Respir Crit Care Med，2013，34(1)：32- 43.

[18]Ford N，Matteelli A，Shubber Z，et al. TB as a cause of hospitalization and in-hospital mortality among people living with HIV worldwide：a systematic review and meta-analysis[J]. J Int AIDS Soc，2016，19(1)：20714.

[19]Zampieri S，Degen W，Ghirardello A，et al. Dephosphorylation of auto antigenic ribosomal P proteins during Fas-L induced apoptosis：a possible trigger for the development of the autoimmune response in patients with systemic lupus erythematosus[J]. Ann Rheum Dis，2001，60：72- 76.

[20]尹婧，叶冬青. HIV诱发系统性红斑狼疮的作用及对疗效的影响[J]. 国外医学：流行病学传染病学分册，2003，30(2)：70- 72.

[21]Deshmukh R，Shah A，Sachdeva KS，et al. Scaling up of HIV-TB collaborative activities：Achievements and challenges in India[J]. Indian J Tuberc，2016，63(1)：4- 7.

[22]Glaziou P，Floyd K，Weil D，et al. TB deaths rank alongside HIV deaths as top infectious killer[J]. Int J Tuberc Lung Dis，2016，20(2)：143- 144.

Bioinformatic Analysis of Differentially Expressed Genes in Peripheral Blood ofHuman Immunodeficiency Virus/Tubercle Bacilli Co-infected Patients

ZHANG Rongqiang1，LIU Qiling1，SUN Na1，KANG Wulin2，YUAN Puwei2

1Department of Epidemiology and Health Statistics，School of Public Health，2Department of Orthopedics，the First ClinicalMedical College，Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang，Shaanxi 712046，ChinaCorresponding author：ZHANG Rongqiang Tel：029- 38185219，E-mail：zhangrqxianyang@163.com

Objective To analyze the differentially expressed genes in peripheral blood of human immunodeficiency(HIV)/tubercle bacilli co-infected patients and explore the biological regulatory mechanism and network of key proteins，so as to provide new evidence for early diagnosis and clinical treatment of HIV/TB co-infected patients. Methods Microarray gene chip data of HIV/TB co-infected patients were downloaded from public databases GEO and imported into the analysis software GEO，STRING，PANTHER，and GenClip. The gene expression profiles，protein interaction networks，processes of molecular biology，and gene functions were analyzed. Results The expression profiles of 15 529 genes between the two groups of patients were similar，and gene expression profiles from 44 subjects were highly correlated. The 251 differentially expressed genes had good diagnostic capabilities in the differential diagnosis of HIV/TB infection. RPLP1 might be a key gene in the diagnosis of HIV/TB infection. The differentially expressed genes and positive regulators showed certain functions such as external stimuli，signal transduction pathways in cells，migration of neutrophils，and immunological and other relevant functionalities. Meanwhile，they may also be involved in free radical-related apoptosis，inflammation，and activation pathways. Conclusions A total of 251 differentially expressed genes are found to be able to distinguish simple HIV infection from HIV/TB infection. Protein-protein interaction network of top 40 differential expression genes includes RPLP1 gene，which is possibly associated with HIV/TB co-infection and may be involved in and the positive regulation of external stimuli，signal transduction pathways in cells，migration of neutrophils，and immunological functions. These findings may provide certain evidence for the diagnosis and treatment of HIV/TB infection.

human immunodeficiency virus；tubercle bacilli；differentially expressed genes；bioinformatics

咸阳市科技局重点项目(2013K12- 01)和陕西中医药大学青年基金项目(2015QN05)Supported by the Key Project of Science and Technology Bureau of Xianyang(2013K12- 01)and the Youth Project of Shaanxi University of Chinese Medicine(2015QN05)

张荣强 电话：029- 38185219，电子邮件：zhangrqxianyang@163.com

R183.9

A

1000- 503X(2017)03- 0336- 09

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.03.007

2016- 09- 06)