顾晓红

（苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 215104）

HPLC考察头孢克洛颗粒的有关物质

顾晓红

（苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 215104）

目的：建立头孢克洛颗粒中头孢克洛有关物质检查的方法。方法：采用高效液相色谱法（HPLC），C18色谱柱；以pH 4.0的0.78%磷酸二氢钠为流动相A，pH 4.0的0.78%磷酸二氢钠-乙腈（55∶45）为流动相B；检测波长220 nm；流速1.0 mL/min；线性梯度洗脱。结果：该方法稳定性RSD为0.44%，平均回收率99.1%，相对标准偏差（RSD）为0.52%，8个厂家的8批样品测定结果均满足要求。结论：该方法专属性好，灵敏度高，可作为测定头孢克洛颗粒有关物质的方法。

高效液相色谱法；头孢克洛颗粒；有关物质

头孢克洛是第二代口服广谱头孢菌素，临床用于治疗敏感菌所致的呼吸道、泌尿道和皮肤、软组织感染及中耳炎等[1]。头孢克洛颗粒在《中华人民共和国药典》（2015年版）未收载有关物质检查项，主要考虑颗粒的辅料成分比较复杂，对检查结果可能会有干扰，但考虑到其在储存和生产过程中易产生杂质，影响安全性和有效性[2]，因此对头孢克洛颗粒进行有关物质考察是有必要的。本次考察主要参照头孢克洛原料及干混悬剂有关物质的测定方法[3-5]，以下是本次考察说明：①《中华人民共和国药典》（2015年版）二部和《欧洲药典》（EP9.0）及《美国药典国家处方集》（USP39-NF34）中头孢克洛有关物质测定方法均采用线性梯度洗脱，前两者方法相同，均以主要杂质对照δ-3异构体考察系统适用性，与后者方法有所差别，《中华人民共和国药典》（2015年版）二部要求头孢克洛在23 min左右出峰，USP39-NF34则要求23～29 min，实际出峰时间更接近《中华人民共和国药典》的规定，在USP39-NF34规定范围内；②《中华人民共和国药典》（2015年版）二部有关物质测定方法为自身对照法，本次考察为便于计算采用头孢克洛对照品的主成分对照外标法；③本次考察拟定的限度参考了《中华人民共和国药典》（2015年版）二部头孢克洛干混悬剂有关物质检查的限度。

1 仪器与试剂

采用岛津LC-20AD高效液相色谱仪；Mettler XS105电子分析天平；头孢克洛对照品（含量95.3%，批号：130481-201205）；头孢克洛δ-3异构体对照品（批号：130494-201204，购自中检院）；头孢克洛颗粒：8个企业（A-H）各选择一批样品；辅料：羧甲基淀粉钠、聚乙烯吡咯烷酮K30、蔗糖、乳化桔子香精，由某企业提供。乙腈为色谱纯；磷酸二氢钠为分析纯。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A为0.78%磷酸二氢钠（用磷酸调节pH至4.0），流动相B为0.78%磷酸二氢钠（pH 4.0）-乙腈（55∶45），检测波长220 nm，流速1.0 mL/min，进样体积20 μL，线性梯度洗脱。见表1。

表1 梯度洗脱表

2.2 溶液配制

溶剂为0.27%磷酸二氢钠溶液（pH 2.5）。

2.2.1 对照品溶液 取头孢克洛对照品25 mg，置50 mL量瓶中，用溶剂溶解制成500 μg/mL的溶液。

取头孢克洛δ-3-异构体对照品25 mg，置25 mL量瓶中，用溶剂溶解制成1000 μg/mL的溶液。

精密移取上述两种对照品溶液各5 mL，置100 mL量瓶中，用溶剂制成分别约含25 μg/mL和50 μg/mL的混合溶液。

2.2.2 供试品及自身对照溶液 取样品适量（约相当于头孢克洛50 mg），置10 mL量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，取续滤液作为供试品溶液；精密量取1 mL，至100 mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

2.2.3 空白辅料溶液 取颗粒空白辅料适量（相当于头孢克洛50 mg的颗粒辅料)，置10 mL量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。

3 结果与讨论

3.1 专属性实验

3.1.1 系统适应性实验 空白辅料、混合对照和供试品溶液的HPLC色谱图见图1。头孢克洛保留时间24.6 min，头孢克洛与头孢克洛δ-3-异构体峰分离度9.7，头孢克洛峰拖尾因子0.98，理论板数按头孢克洛峰计算为89695。已获得的辅料峰不干扰主峰，同时与杂质峰完全分离， 各杂质峰与主峰完全分离，本方法系统适应性符合检测要求。

图1 空白辅料、混合对照、供试品溶液HPLC图

3.1.2 破坏实验 ①酸破坏产物的制备：取A企业样品适量（约相当于头孢克洛50 mg），置10 mL量瓶中，加1 mol/L盐酸适量浸润，静置1 h，用1 mol/L氢氧化钠中和后加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。②碱破坏产物的制备：取A企业样品适量（约相当于头孢克洛50 mg），置10 mL量瓶中，用1 mol/L氢氧化钠适量浸润，立即用1 mol/L盐酸溶液中和后加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。③氧化破坏产物的制备：取A企业样品适量（约相当于头孢克洛50 mg），置10 mL量瓶中，用30%过氧化氢适量浸润，静置1 h，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。④光破坏产物的制备：取A企业样品适量（约相当于头孢克洛50 mg），置10 mL量瓶中，置4500 lx强光下照射5天，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。⑤热破坏产物的制备：取A企业样品适量（约相当于头孢克洛50 mg），置10 mL量瓶中，105℃烘箱中放置1 h，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

破坏试验结果表明，在强酸、强碱中主成分全部降解破坏，氧化后在6.8 min，10.8 min处有较大破坏产物，热破坏也增加了几个小的杂质峰，光照对峰影响较小。综上所述，强酸、强碱和强氧化对头孢克洛颗粒的性质影响很大，同时表明本色谱系统破坏产物与主成分峰完全分离。

3.2 精密度试验

取“2.2.2”项下的供试品溶液，连续进样6次，峰面积测得结果为122915296，122917960，123546606，123836596，124030541，1241345421，RSD为0.44%，结果表明，本法进样精密度良好。

3.3 检出限试验

取“2.2.1”项下的对照溶液，用溶剂逐级稀释制成系列浓度进样检测，当信噪比为3∶1时，头孢克洛的最低检测限度为0.25 ng左右，头孢克洛δ-3-异构体的最低检测限度为1 ng左右。

3.4 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液及其自身对照溶液，分别于0，2，4，6，12，24，36 h进样，记录色谱图，主峰峰面积无明显的降解。结果表明该溶液在室温条件下稳定性良好，不过为避免温度影响，USP39-NF34明确规定，样品液在室温条件下应2 h内进样，冰箱保存条件下在20 h内应进样。

3.5 线性试验

精密称取头孢克洛对照品12.5 mg，置50 mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，置10 mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为头孢克洛对照品系列浓度溶液。取上述溶液进样。以峰面积A为纵坐标，浓度C（μg/mL）为横坐标，进行线性回归。头孢克洛在25～75 μg/mL内，与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程：

A＝31999C＋21142，

相关系数r＝0.9999。

精密称取δ-3头孢克洛对照品20 mg，置20 mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 mL，置20 mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为δ-3头孢克洛对照品系列浓度溶液。取上述溶液进样。以峰面积A为纵坐标，浓度C（μg/mL）为横坐标，按最小二乘法进行线性回归。δ-3头孢克洛浓度在25～150 μg/mL内，与峰面积呈良好的线性关系，线性回归方程：

A＝35782C＋36433，

相关系数r＝0.9999。

3.6 准确度试验

精密称取A企业样品适量（约相当于头孢克洛50 mg），置10 mL量瓶中，加入δ-3头孢克洛对照品0.8，1.0，1.2 mL，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过。分析结果见表1，可见该方法的准确度良好。

3.7 样品测定

共考察不同厂家的供试品8批，结果见表2。

表1 有关物质回收率结果（n＝6）

表2 头孢克洛颗粒有关物质检测结果

4 结论

参照《中华人民共和国药典》（2015年版）二部头孢克洛干混悬剂有关物质检查项下要求[1]，8批样品均在限度范围内，即单个杂质峰面积均小于对照溶液主成分峰面积的2倍（2.00%），各杂质峰面积和均小于对照溶液主成分峰面积的3倍（3.00%），本实验建立的HPLC方法真实反映了市场上头孢克洛颗粒的质量情况，该方法专属性好，灵敏度高，可作为检测头孢克洛颗粒有关物质的方法，对进一步提高头孢克洛颗粒的标准具有积极意义，更保证了药品使用的安全性和有效性。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2015年版）二部[S].北京:中国医药科技出版社,2015:258-261.

[2]刘海涛,张寒,王俊秋,等.北京地区市售头孢克洛胶囊质量评价[J].首都医药,2011,18(12):48-49.

[3]李蔷薇,李强,邓俊丰,等．HPLC法测定头孢克洛原料中杂质C的研究[J].中国抗生素杂志,2015,40(8):599-602.

[4]向世英,林波,梁振益.头孢克洛干混悬剂中有关物质的研究[J].化学分析计量,2009,18(1):44-47.

[5]傅小英,郑悦,田增光,等.头孢克洛胶囊有关物质考察[J].解放军药学学报,2013,29(3):244-246.

本文编辑：张钰

Determination of Relevant Substances in Cefaclor Granules by HPLC

Gu Xiao-hong

(Suzhou Research Center for Drug Control and Detection, Jiangsu Suzhou 215104, China)

Objective：To establish a method for determination of cefaclor-related substances in cefaclor granules. Methods：HPLC was adopted by using a C18column, serving 0.78% sodium dihydrogen phosphate (pH 4.0) as the mobile phase A and 0.78% sodium dihydrogen phosphate (pH 4.0)-acetonitrile (55∶45) as the mobile phase B. The detection wavelength was 220 nm, while the flow rate was 1.0 mL/min. Linear gradient elution was adopted. Results：The RSD in stability test was 0.44%. The average recovery was 99.1% with a RSD of 0.52%. All the determination results of eight batches of samples from eight manufacturers were satisfied. Conclusion：The method is specific and sensitive, which may be for the determination of cerfaclor-related substances in cefaclor granules.

HPLC; Cefaclor Granules; Related Substances

R917

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.04.009

2017-02-03

顾晓红，女，硕士，主管药师。研究方向：药品质量检验。E-mail：callmegxh@126.com