武果桃，牛国庆，牛琛，任杰，孟冬霞，赵娟，卫顺生

（1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，太原 030032；2.太原市小店区畜禽繁育工作站，太原 030032；3.东北农业大学，哈尔滨 150030）

直接提取病原菌DNA检测奶牛隐性乳房炎试验

武果桃1，牛国庆2，牛琛3，任杰1，孟冬霞1，赵娟1，卫顺生1

（1.山西省农业科学院畜牧兽医研究所，太原 030032；2.太原市小店区畜禽繁育工作站，太原 030032；3.东北农业大学，哈尔滨 150030）

为研究奶牛隐性乳房炎主要致病菌的快速检测方法，本试验选取山西省太原市小店区某规模化奶牛场39头隐性乳房炎患牛，利用Chelex-100方法直接提取奶样金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及停乳链球菌DNA进行检测。结果表明，利用Chelex-100方法直接提取奶样中病原菌DNA检测奶牛隐性乳房炎，具有简单、快速、经济、无污染、PCR敏感性高等优点，对PCR快速检测奶牛隐性乳房炎具有重要意义。

Chelex-100；病原菌；奶牛；隐性乳房炎；DNA

目前，乳房炎仍然是影响奶牛生产效益的主要因素之一[1]，不仅降低奶牛生产性能，严重时还会导致奶牛淘汰。据报道，国内奶牛乳房炎的发病率为20%～70%，每年造成的直接经济损失超过21亿人民币[2]。相对于临床型乳房炎，奶牛隐性乳房炎流行面广，发病头数为临床型乳房炎的15～40倍，约占乳房炎发病头数的90%[3～5]，不但引起产奶量降低4%～10%，还影响乳品质量及奶牛繁殖[6,7]。奶牛隐性乳房炎因无明显临床症状而容易被忽视，如不积极采取措施则易转变为临床型乳房炎。引起奶牛乳房炎的病原微生物主要是金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌、化脓性棒状杆菌等。葡萄球菌和链球菌是引起奶牛隐性乳房炎的主要病原菌，约占乳房炎病原菌总数的90%以上。奶牛乳房炎病原菌所占的比例依次为停乳链球菌(40.91%)、金黄色葡萄球菌(27.28%)、无乳链球菌(13.64%)、乳房链球菌(9.09%)。大肠埃希菌 (9.09%)，此外，支原体、病毒等也可引起奶牛隐性乳房炎[8,9]。

目前，检测奶牛乳房炎致病菌的“金标准”仍是传统的培养法，但该方法费时、费力，需要72h甚至更长时间[10]。本试验采用Chelex-100法直接从乳房炎患牛的乳汁中提取病原菌DNA并进行PCR扩增，检测金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌，以探求一种快速、高效的检测奶牛隐性乳房炎病原菌的方法。

1 材料与方法

1．1 奶样采集

2015年9月，在太原市小店区某规模奶牛场挑选39头隐性乳房炎患牛（CMT检测），每头患牛无菌采集奶样10mL，4℃条件下，及时送测试中心用于病原微生物检测。

1．2 试剂及仪器

试剂：D N A提取试剂盒E S溶液、P B S缓冲液、溶葡球菌酶、Chelex-100；引物、Pfu DNA Polymerase 高温聚合酶、MgCl2（25mmol/L）、10×PCR Buffer(无 Mg2+：100mmol/L Tris-HCl，pH 8.8，25℃；500mmol/L KCl，0.8%(v/v)Nonidet、dNTP（10mmol/L）、6×DNA Loading Dye、DNA marker、10×TAE（400mmol/L Tris-acetate and 10mmol/L EDTA，pH8.0）、PCR产物纯化回收试剂盒、无水乙醇、异丙醇、丙三醇，均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

仪器：美国Verity 96well PCR仪、英国Syngene Gene Genius ABI凝胶成像仪、美国 ABI3730XL测序仪。

1．3 试验设计

1.3.1 奶样DNA提取

Chelex-100法：取奶样0.8mL加入到0.4mL ES溶液[0.5mol/L EDTA（pH 7.5）、0.2%SDS]中，混匀，37℃静置10min；12 000r/min离心10min，弃上清；加入1mL PBS缓冲液（137mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl、10mmol/L Na2HPO4、2mmol/L KH2PO4，pH 7.4），振荡摇匀，10 000r/min离心5 min，弃上清，重复1次；加入25μL以灭菌超纯水配制的0.02mg/mL溶葡球菌酶，置于37℃ 30 min；加入175μL以灭菌超纯水配制的10% Chelex-100，剧烈振荡5～10s，置于100℃沸水中10min；剧烈振荡5～10s，12 000r/min离心5min，上清液用于PCR扩增。

1.3.2 引物设计与合成

参照文献[11]设计金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌的扩增引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物信息详见表1。

表1 引物信息

1.3.3 PCR扩增及产物测序

细菌DNA提取在山西省农业科学院畜牧兽医研究所进行，PCR产物测序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

50μLPCR反应体系：模板1μL、上下游引物各1μL、dNTP（10mmol/L）1μL、Taq Buffer 5μL、25mmol/L Mgcl25μL、Taq酶（5U/μL）0.5μL、去离子水35.5μL。

PCR扩增条件：95℃预变性3min；94℃变性30s；55～60℃退火35s，72℃延伸40～50s，35个循环；72℃延伸5～8min。

2 结果与分析

2．1 PCR电泳结果

图1 不同致病菌DNA的PCR电泳结果注：（1）A为金黄色葡萄球菌，B为大肠杆菌，C为无乳链球菌；（2）B、C中样品编号18～39因无目的条带而未列出。

由图1可知，39份奶样中，33份样品检测出金黄色葡萄球菌；14份样品检测出大肠杆菌；1份样品检测出无乳链球菌。数据表明，该牛场隐性乳房炎患牛的奶样中，以金黄色葡萄球菌检出率为最高，其次为大肠杆菌、无乳链球菌，30%～36%的奶样存在多重感染。

2．2 测序结果

将上述3种病原菌的PCR产物进行测序，并与GenBank收录的序列进行比对，其同源性在99.5%以上，证明PCR扩增的各基因片段为相应的目的基因片段。

3 讨论

隐性乳房炎会降低乳腺腺泡腔的容积和产奶量，从而影响终生产奶量[12,13]，但因不表现临床症状，在生产中极易被忽视。隐性乳房炎若没有得到较好的处理，则很容易发展成临床型乳房炎，增加淘汰几率[14,15]。

Chelex-100是一种弱阳离子螯合树脂，可用于从微量精斑、血痕、毛发、口腔拭子等中提取DNA，常用于法医的PCR鉴定[16,17]。在临床兽医学领域，针对目前我国奶牛隐性乳房炎的高发病率和诊断技术相对落后的现状，根据Chelex-100法可直接快速提取病原菌DNA的特点，本试验直接提取奶样中病原菌DNA进行奶牛隐性乳房炎检测，结果表明，该方法是完全可行的，而且简单快速，不需要有机溶剂，全程仅需2.5h，非常适合大量奶样DNA的提取检测。

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Study on Direct Extraction of Pathogenic Bacteria DNA to Detect Cows Recessive Mastitis

WU Guo-tao1, NIU Guo-qing2, NIU Chen3, REN Jie1, MENG Dong-xia1, ZHAO Juan1, WEI Shun-Sheng1
(1.Animal Husbandry and Veterinary Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030032; 2.Xiaodian Livestock and Poultry Breeding Station, Taiyuan 030032; 3.Northeast Agricultural University, Harbin 150030)

In order to develop a rapid detection method of the main pathogenic bacteria for cows recessive mastitis, totally, 39 recessive mastitis cows in a large-scale dairy farm of Taiyuan, Shanxi Province were selected in this study, the Chelex-100 method was used to directly extract DNA from milk sample to detect staphylococcus aureus, Escherichia coli and Stop milk streptococcal. Results showed that samples from the milk of pathogenic microorganisms was given priority to with Staphylococcus aureus and Escherichia coli. The method using Chelex-100 for pathogenic bacteria DNA in directly extracted from milk sample was simple, rapid, economic, pollution-free and with high PCR sensitivity, recessive mastitis cows for PCR rapid detection of pathogenic bacteria was of great significance.

Chelex-100; Pathogenic bacteria; Cows; Recessive mastitis; DNA

S858.23

A

1004-4264（2017）05-0029-03

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.05.008

2016-08-16

山西省科技攻关项目（201603D221021-2）；山西省农科院重点攻关项目（YZD1411）。

武果桃（1967-），汉族，山西太谷人，副研究员，主要从事中兽药防治动物疾病的工作。

牛国庆。