陈伟 刘海生 魏萌 王丽红 师艳艳



熊果酸对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响研究

陈伟 刘海生 魏萌 王丽红 师艳艳

目的 研究熊果酸对人骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响及其相关机制。 方法 以不同浓度熊果酸(40、20、10 μg/mL)和顺铂(40 μg/mL)干预对数生长期人骨肉瘤MG-63细胞；采用噻唑蓝比色法测定细胞增值抑制率，通过流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测细胞周期和细胞凋亡状况，采用逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测细胞中Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)mRNA、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia，bcl-2)mRNA的表达，采用免疫印迹法(western blotting，WB)检测细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)蛋白表达。 结果 经熊果酸干预48小时能够显著提高人骨肉瘤MG-63细胞增殖抑制率，延长细胞周期G0/G1期并缩短G2/M期，提高细胞凋亡率(apoptosis index，AI)，上调Bax mRNA表达并下调bcl-2 mRNA表达、提高Bax/bcl-2比值，上调caspase-3蛋白表达，熊果酸上述作用具有一定的剂量依赖性。 结论 熊果酸具有抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖并促进其凋亡的作用，其机制可能与熊果酸能够阻滞细胞周期以及调节凋亡相关基因和蛋白表达有关。

熊果酸； 骨肉瘤； MG-63细胞； 增殖； 凋亡

骨肉瘤发病率居原发恶性骨肿瘤之首[1-2]，每年新发患者约5/100万[3]，多发于青少年且死亡率高，是临床上亟待解决的一个难题。目前临床上对于骨肉瘤的治疗主要采取手术辅以放化疗的方案，但80 %的患者因确诊时体内已经出现转移病灶而致使手术治疗效果不佳[4]，5年生存率仅30 %左右。因此，以抑制骨肉瘤细胞生长为切入点研究高效、低毒的新型抗肿瘤药物以及新的治疗方案是临床上亟待解决的问题。熊果酸(ursolic acid，UA)是一种具有抗氧化、抗炎、抗纤维化等多种生物学活性的五环三萜类化合物[5-10]，广泛存在于熊果、女贞子等植物中；现代药理学研究发现熊果酸对肺癌、肝癌、舌癌细胞等生长均具有一定的抑制作用[11-13]，但熊果酸是否对人骨肉瘤MG-63细胞生长具有抑制作用尚未见文献报道。本实验通过体外培养人骨肉瘤MG-63细胞并给予熊果酸进行干预治疗，研究熊果酸对人骨肉瘤MG-63细胞生长的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物与试剂

人骨肉瘤MG-63细胞株引自河北医科大学细胞生物研究室；熊果酸购自陕西慧科植物开发有限公司(纯度≥98%，批号：140617)；注射用顺铂购自山东齐鲁制药有限公司(批号：1503018)；DMEM 高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清购自美国HyClone公司(批号分别为：15010037、15040127、15050009)；MTT购自美国Sigma公司(批号：M2128)；Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司(批号：150419)；Caspase-3单克隆抗体购自碧云天生物技术有限公司(20150127)；bcl-2、Bax上下游引物购自上海博亚生物公司(批号分别为：20150216、20150120)。

1.2 主要仪器

超净工作台(购自苏州安泰空气技术有限公司)；二氧化碳细胞培养箱(购自美国Thermo Scientific公司)；酶标仪(购自美国 BIO-RAD公司)；DYY-11 型多用电泳仪、DYCZ-40B 转印泳槽(购自北京六一仪器厂)；流式细胞仪(购自美国BD公司)；RT-PCR仪(购自武汉新未来仪器技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养、分组与给药 人骨肉瘤MG-63细胞株经复苏后植入DMEM高糖培养基进行培养并取对数生长期细胞进行下一步实验：0.25%胰酶消化、调整细胞浓度为5×104/mL后分为空白对照组、熊果酸低、中、高剂量(10、20、40 μg/mL)组和顺铂(40 μg/mL)组，n=10；各组分别给予相应浓度药物进行干预，48小时后行各指标检测。

1.3.2 各组人骨肉瘤MG-63细胞增值抑制率的测定 调整细胞浓度至5×104/mL，接种于96孔板，每孔滴加20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，培养4小时后去上清，加入DMSO 200 μL，振荡10分钟后通过酶标仪测定波长570 nm处吸光度(optical delnsity，OD)值，计算各组人骨肉瘤MG-63细胞增值抑制率：细胞增殖抑制率(%)=[1-(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)]×100%

1.3.3 细胞周期的检测和细胞凋亡状况的观察 各组细胞经PBS洗涤、加入70%乙醇5 mL混匀并置4℃环境48小时后离心取细胞，经PBS洗涤并打散细胞团后加5 μL水解酶Rnase(10 mg/mL)，置37℃环境1小时，加入碘化丙啶染液，避光孵育30分钟，然后通过流式细胞仪进行检测，采用CELL Quest软件分析各组细胞的细胞周期时相及凋亡状况。

1.3.4 各组MG-63细胞bcl-2 mRNA、bax mRNA表达的检测及Bax/bcl-2比值的计算 通过基因文库查询并设计合成bcl-2、Bax、β-actin基因上、下游引物；bcl-2引物：上游5′-GGGATGCCTTTGTGGAACTA-3′，下游5′-TGATTTGACCATTTGC CTGA-3′；bax引物：上游5′-ATCCAGGATCGAGCAGG GAGGATGG- 3′，下游5′-AGATGGTCACTGTCTGCCATGTGGG-3′；β-actin引物：上游5′-CCTGTATGCC TCTGGTCGTA-3′，下游 5′-CCATCTCTTGCTCGAAGTCT-3′。经药物干预48小时后，0.25 %胰酶消化并收集各组细胞，加入适量TRIzol试剂提取总RNA并测定总RNA浓度，反转录为cDNA后进行PCR反应，扩增完毕后取PCR产物于琼脂糖凝胶电泳，最后通过凝胶成像仪观察并照相。以β-actin为内参，以灰度值进行半定量分析bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达并计算Bax/bcl-2表达比值。

1.3.5 各组人骨肉瘤MG-63细胞Caspase-3蛋白表达的检测 各组细胞经PBS溶液洗涤后行超声裂解，低温离心(4℃，12000 rpm)20分钟取沉淀，采用BCA法测定蛋白浓度，蛋白变性(沸水浴加热5分钟)、上样(每孔上样30 μg)，经SDS-PAGE凝胶电泳后转PVDF膜、室温下5%脱脂奶粉封闭2小时，一抗(Caspase-3，β-actin)4℃过夜，洗膜、二抗(1∶100)室温孵育1小时后经ECL系统显影；以β-actin为内参，以条带灰度值测定Caspase-3表达相对量。

1.4 统计学处理

运用软件SPSS 15.0进行统计分析，组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组人骨肉瘤MG-63细胞增殖抑制率

通过MTT比色法检测细胞增殖抑制率，结果如表1所示：熊果酸各剂量组和顺铂组人骨肉瘤MG-63细胞增殖抑制率显著高于空白对照组(P<0.01)，且熊果酸对MG-63细胞增殖抑制作用呈现一定剂量依赖性；熊果酸高剂量组细胞增殖抑制率显著高于顺铂组(P<0.05)。

表1 各组人骨肉瘤MG-63细胞增殖抑制率比较

注： 与空白对照组比较，aP<0.01；与顺铂组比较，bP<0.05。

2.2 各组人骨肉瘤MG-63细胞周期

通过流式细胞术检测细胞周期，结果如表2所示：熊果酸中、高剂量组人骨肉瘤MG-63细胞周期G0/G1期较空白对照组显著延长，S期和G2/M期显著缩短(P<0.05，P<0.01)，其中熊果酸高剂量组较顺铂组具有统计学差异(P<0.05)。

表2 各组人骨肉瘤MG-63细胞周期比较

注： 与空白对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与顺铂组比较，cP<0.05。

2.3 各组人骨肉瘤MG-63细胞凋亡

采用流式细胞术检测细胞凋亡状况，结果如图1所示：经熊果酸各剂量组和顺铂组人骨肉瘤MG-63细胞凋亡细胞数明显增多，熊果酸诱导细胞凋亡的作用呈现一定的剂量依赖性；计算AI结果如表3所示：熊果酸各剂量组和顺铂组人骨肉瘤MG-63细胞AI显著高于空白对照组(P<0.01)，其中熊果酸高剂量组人骨肉瘤MG-63细胞AI显著高于顺铂组(P<0.05)。

表3 各组人骨肉瘤MG-63细胞凋亡比较

注： 与空白对照组比较，aP<0.01；与顺铂组比较，bP<0.01。

注：A空白对照组；B熊果酸低剂量组；C熊果酸中剂量组；D熊果酸高剂量组；E顺铂组

β-actin mRNA bcl-2 mRNA Bax mRNA

注：自左至右依次为：空白对照组、熊果酸低剂量组、熊果酸中剂量组、熊果酸高剂量组、顺铂组

图2 各组人骨肉瘤MG-63细胞bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达

2.4 各组人骨肉瘤MG-63细胞bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达和Bax/bcl-2比值

采用RT-PCR技术检测并通过灰度值进行半定量分析，结果如图2和表4所示：熊果酸中、高剂量组和顺铂组人骨肉瘤MG-63细胞bcl-2 mRNA表达显著下调，且Bax mRNA表达显著上调(P<0.05，P<0.01)，Bax/bcl-2比值显著提高(P<0.05，P<0.01)；其中熊果酸高剂量组bcl-2 mRNA表达较顺铂组显著降低(P<0.05)、Bax/bcl-2比值显著升高(P<0.05)。

表4 各组人骨肉瘤MG-63细胞bcl-2 mRNA、Bax mRNA表达和Bax/bcl-2值对比

注： 与空白对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与顺铂组比较，cP<0.05。

2.5 各组人骨肉瘤MG-63细胞Caspase-3蛋白表达

通过Western blotting技术检测并通过灰度值进行半定量分析，结果如图3和表5所示：熊果酸各剂量组和顺铂组人骨肉瘤MG-63细胞Caspase-3蛋白表达较空白对照组显著上调(P<0.05，P<0.01)，熊果酸对Caspase-3蛋白表达的调控作用呈现一定的剂量依赖性；熊果酸高剂量组Caspase-3蛋白表达量显著高于顺铂组(P<0.05)。

注：自左至右依次为：空白对照组、熊果酸低剂量组、 熊果酸中剂量组、熊果酸高剂量组、顺铂组

图3 各组人骨肉瘤MG-63细胞caspase-3蛋白表达

表5 各组人骨肉瘤MG-63细胞Caspase-3蛋白表达比较

注： 与空白对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与顺铂组比较，cP<0.05。

3 讨论

熊果酸是一种具有多种生物学活性的五环三萜类化合物[5-10]，近年来熊果酸抗肿瘤活性逐渐得到医药研究工作者的关注，付伦等[11]研究发现熊果酸能够通过阻滞细胞周期于G0/G1期而对肺癌A549细和SPCA1细胞增殖起到抑制作用；崔兵兵等[12]研究发现熊果酸能够诱导细胞凋亡而表现出对肝癌SMMC-7721细胞生长的抑制作用；李爱霞等[13]发现熊果酸能够诱导人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞凋亡而抑制其生长；此外，熊果酸对卵巢癌、宫颈癌等妇科肿瘤细胞生长具有抑制作用[14-15]。本研究通过体外培养人骨肉瘤MG-63细胞并给予不同浓度熊果酸进行干预并以顺铂作为阳性对照进行研究发现，熊果酸能够呈剂量依赖性地阻滞人骨肉瘤MG-63细胞周期、抑制增殖并提高其细胞凋亡率，且熊果酸高剂量组均优于顺铂组，提示熊果酸具有抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖并促进其凋亡的作用。

Caspase是激活各种凋亡刺激因子(Apaf-1)的关键蛋白酶，参与细胞凋亡的启动及整个凋亡过程的调节；bcl-2能够抑制线粒体破裂，可直接与Apaf-1结合而抑制Caspase-3激活，抑制促凋亡蛋白Bax细胞毒性作用，调节细胞内钙浓度，从而起到抑制细胞凋亡的作用[16-17]；Bax属于Bcl-2基因家族成员，具有诱导线粒体渗透性改变而释放细胞色素C、激活促凋亡蛋白Caspase-9，而表现出促细胞凋亡作用[18]。此外，Bax能够与bcl-2聚合成二聚体，从而抑制bcl-2活性而促进细胞凋亡，所以Bax/bcl-2比值更加能够体现Bcl-2基因家族对细胞凋亡的调控作用[19-21]。本研究发现，熊果酸能够有效上调人骨肉瘤MG-63细胞Bax mRNA表达、下调bcl-2 mRNA表达并提高Bax/bcl-2比值，上调Caspase-3蛋白表达，这可能是熊果酸诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的重要分子机制。

总之，熊果酸具有抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖并促进其凋亡的药理学作用，其作用机制可能与熊果酸阻滞细胞周期于G0/G1期以及调节凋亡相关基因(Bax、bcl-2)和蛋白(Caspase-3)表达有关。

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(本文编辑： 韩虹娟)

Effects of ursolic acid on the proliferation and apoptosis of human osteosarcoma MG-63 cells

CHENWei，LIUHaisheng，WEIMeng，etal.

ThirdDepartmentofOrthopedics，HandanCentralHospital，Handan056001，China

CHENWei,E-mail:hdsyyzhrf@163.com

Objective To investigate the effects of Ursolic Acid(UA) on the proliferation and apoptosis of human osteosarcoma MG-63 cells. Methods The human osteosarcoma MG-63 cells in logarithmic growth phase was treated with UA (10, 20, 40μg/mL) and Cisplatin (40μg/mL). The cellular growth inhibition rate was calculated by MTT, cell cycle and apoptosis rate were analyzed by flow cytometry, the expression of Bax mRNA and bcl-2 mRNA were detected by RT-PCR, the expression of caspase-3 protein was detected by western blotting. Results The cellular growth inhibition rate of human osteosarcoma MG-63 cell in UA treated groups were significantly increased; the G0/G1 phase of the cell cycle was prolonged and the G2/M phase was shortened, the apoptosis rate was significantly increased; the expression of Bax mRNA was significantly increased, while the expression of bcl-2 mRNA was significantly decreased, and the ratio of Bax/bcl-2 was significantly increased; the expression of caspase-3 protein was significantly increased; all of the effects above were dose-dependent with a certain. Conclusions UA can effectively inhibit human osteosarcoma MG-63 proliferation and promote it apoptosis, which perhaps related to its effects of arresting cell cycle and regulating the expression of apoptosis-related genes and proteins.

Ursolic Acid; Osteosarcoma; MG-63 cell; Proliferation; Apoptosis

056001 邯郸市中心医院骨三科(陈伟、魏萌、王丽红、师艳艳)；邯郸市人民医院外一科(刘海生)

陈伟(1976- )，硕士，副主任医师。研究方向：骨科疾病研究。E-mail：hdsyyzhrf@163.com

R738.1

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.04.013

2016-07-03)