高 宁， 刘 洒 洒， 包 汭 琪， 谢 同 舟， 纪 超 凡， 董 秀 萍， 林 心 萍

( 1.大连工业大学 食品学院， 辽宁 大连 116034；2.大连工业大学 国家海洋食品工程技术研究中心， 辽宁 大连 116034 )

营养胁迫调控弯曲隐球酵母转化N-乙酰-D-葡萄糖胺生产油脂

高 宁1,2， 刘 洒 洒1,2， 包 汭 琪1,2， 谢 同 舟1,2， 纪 超 凡1,2， 董 秀 萍1,2， 林 心 萍1,2

( 1.大连工业大学 食品学院， 辽宁 大连 116034；2.大连工业大学 国家海洋食品工程技术研究中心， 辽宁 大连 116034 )

以一株可利用N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)为唯一碳源的菌株——弯曲隐球酵母(CryptococcuscurvatusATCC 20509)为研究对象，分别采用磷元素限制和硫元素限制，考察对其油脂积累的影响，并对脂肪酸组分进行了分析。结果表明，磷、硫元素均可调控该酵母在氮源丰富条件下的油脂积累，油脂含量和油脂得率随碳磷摩尔比的增高而增高，随碳硫摩尔比的增高呈先上升后下降的趋势。脂肪酸组分分析表明，饱和脂肪酸含量随着碳磷摩尔比的增加先下降后上升，随着碳硫摩尔比的增加呈先上升后下降的趋势。

弯曲隐球酵母；油脂；营养胁迫

0 引 言

随着油脂需求量的日益增加，动植物油脂已经不足以满足人类的需求，开发微生物油脂迫在眉睫[1-2]。近年来，采取了多种油脂合成的调控策略，其中氮元素限制(即高n(C)/n(N))是现有最常用的调控策略[3-4]。除氮源外，磷、硫和金属元素等成分的改变也可对油脂合成产生影响[5-6]。Wu等[7]在氮源丰富的情况下，改变培养基中的n(C)/n(P)，微生物中油脂的含量显著提高；而在培养基中加入低浓度的Na2SO4可促进油脂合成[8]。这些调控方式为自然界中富氮生物质的利用提供了灵活的策略。甲壳素是自然界中含量仅次于纤维素的一种多糖，是海洋中的第一大生物质。然而以甲壳素单体——N-乙酰-D-葡萄糖胺生产微生物油脂的报道较为少见[9-10]，原因在于N-乙酰-D-葡萄糖胺中氮含量高，不适合于常规的氮限制调控策略。

本实验以前期筛选的一株可利用N-乙酰-D-葡萄糖胺为唯一碳源的弯曲隐球酵母为研究对象[10]，分别采用硫元素限制和磷元素限制两种调控方式，探讨其在富氮培养基中积累油脂的能力，并分析不同培养条件下的脂肪酸组成成分，以期为富氮生物质为原料的微生物油脂工业化生产提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 种

弯曲隐球酵母CryptococcuscurvatusATCC 20509，美国ATCC菌种保藏中心。

1.1.2 培养基

种子培养基(g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨 10，酵母粉 10，pH 6.0。

限磷培养基(g/L)：GlcNCOOH 70，(NH4)2SO45.0，MgSO40.732，痕量元素溶液10 mL/L。以KH2PO4为磷元素的添加，质量浓度分别为3.6、0.5和0.01 g/L[7]。

限硫培养基(g/L)：GlcNCOOH 70，MgCl2·6H2O 1.5，Na2HPO41.0，KH2PO41.0，痕量元素溶液10 mL/L。以Na2SO4为硫元素的添加，质量浓度分别为2.0、0.5和0.01 g/L[8]。

痕量元素溶液配方(g/L)：CaCl2·2H2O 4.0， 水合柠檬酸 0.52， FeSO4·7H2O 0.55， MnSO4·H2O 0.076， ZnSO4·7H2O 0.10， 100 μL 18 mol/L H2SO4。

1.2 方 法

1.2.1 种子液制备

将活化的酵母菌接种于50 mL种子液，200 r/min，28 ℃培养25 h。7 800g离心8 min，0.9%无菌生理盐水清洗2次，再用50 mL的0.9%无菌生理盐水重悬。种子液以OD600=0.35取5 mL 接种于45 mL培养基，200 r/min，28 ℃培养，每24 h调pH至5.3～5.6，摇瓶培养121 h。

1.2.2 菌体生物量的测定

发酵液于7 800g离心8 min，105 ℃下菌体烘干至恒重，测定菌体生物量。

1.2.3 残糖的测定

采用Imoto的方法测定培养基中N-乙酰-D-葡萄糖胺剩余量。以N-乙酰-D-葡萄糖胺质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。公式为y=4.414x+0.003(R2=0.995)。

1.2.4 微生物脂质体生物成像分析

微生物积累油脂后其胞内存在的脂肪体 (lipid body) 可在光学显微镜下观测到，取发酵液于40倍物镜进行镜检并拍照。

1.2.5 油脂的提取

采用酸热法[11]，以每升发酵液中含油脂的克数(g/L)表示油脂量；油脂含量为油脂量占生物量的质量分数；油脂得率为每克糖所生成的油脂质量。

1.2.6 菌油脂肪酸组分分析

脂肪酸甲酯化处理：取油脂约0.1 g，加入2 mL 0.5 mol/L KOH-CH3OH，60 ℃水浴2 h。冷却后用6 mol/L盐酸调pH小于1.0，10 mL正己烷萃取，氮吹至恒重，再加1 mL正己烷和2 mL 甲基化试剂，70 ℃水浴1 h，冷却后取出正己烷层水洗至中性，加入无水硫酸钠干燥过夜。

采用安捷伦6890N GC-5973 MSD气质联用仪分析。HP-5-MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为氦气。分析条件：初始温度50 ℃，保持1 min；以50 ℃/min升至170 ℃；以4 ℃/min 升至300 ℃；以40 ℃/min升到320 ℃，保持3.6 min。选取Scan模式，分析采用EI源(70 eV)，溶剂延迟4 min，扫描范围50～550m/z。

2 结果与讨论

2.1 磷元素限制调控对弯曲隐球酵母产油的影响

2.1.1 不同浓度的磷酸盐对弯曲隐球酵母生长及油脂量的影响

设置3种n(C)/n(P)的培养基，于培养基中加入不同量的KH2PO4，形成n(C)/n(P)为96、689、34 451三种培养环境，n(C)/n(P)=96为对照组。由表1可见，培养121 h后，随着n(C)/n(P) 的增大，生物量呈逐渐下降的趋势，其中对照组的生物量为22.9 g/L，说明在该环境中菌体营养丰富，生物量增长较快，然而油脂含量仅为10.4%，油脂生产量只有2.4 g/L，油脂得率为0.039 g/g，糖转化为油脂的效率低，说明碳源绝大部分应用于菌体合成，未用于油脂合成；实验组n(C)/n(P)=689和n(C)/n(P)=34 451组的生物量分别为10.6和8.0 g/L，较n(C)/n(P)=96组均较低，说明菌体可能由于缺乏磷元素处于生长不良的状态。实验组n(C)/n(P)=689中，虽然残糖剩余较多，但在相同的时间内，菌体油脂含量达到24.7%，油脂量也较对照组有所增长。实验组n(C)/n(P)=34 451中的菌体油脂含量增加到63.2%，油脂生产量为5.2 g/L，为n(C)/n(P)=96时的2.16倍，油脂得率也为对照组的2.48倍，说明当磷元素受到限制时，碳源绝大部分流向油脂合成途径。Wu等[9]采用弯曲隐球酵母发酵N-乙酰-D-葡萄糖胺，在120 h时，耗糖量约为65 g/L，胞内油脂质量分数达到45.4%。而在本实验中，弯曲隐球酵母消耗52.7 g/L的N-乙酰-D-葡萄糖胺，可积累超过细胞干重63.2% 的油脂。可见采用磷元素限制的调控策略能够使得N-乙酰-D-葡萄糖胺更多的流向油脂合成方向。

对发酵终点微生物菌体进行脂质体生物成像分析，结果如图1所示。在n(C)/n(P)为96(图1(a))的培养条件下，弯曲隐球酵母胞内含有较少的油脂；而当n(C)/n(P)提高到689和34 451(图1(b)、(c))，发酵终点的菌体中可观测到明显的油滴状物质，该结果与油脂含量分析的结果吻合。

表1 不同质量浓度的KH2PO4条件下弯曲隐球酵母生长及产油结果

(a) ρ(KH2PO4)=3.6 g/L

(b) ρ(KH2PO4)=0.5 g/L

(c) ρ(KH2PO4)=0.01 g/L

图1C.curvatusATCC 20509在不同质量浓度的KH2PO4条件下微生物脂质体成像结果

Fig.1 Liposomes results ofC.curvatusATCC 20509 at different KH2PO4concentrations

结果表明，弯曲隐球酵母在含低浓度的KH2PO4培养基中生长时，糖代谢流能选择性地转向油脂生物合成，随着磷元素含量的降低，油脂量显著增加。因此，在氮元素丰富的情况下，较强的磷胁迫可用于调控微生物的油脂生产。

2.1.2 不同浓度的磷酸盐对弯曲隐球酵母油脂成分的影响

采用GC-MS对不同n(C)/n(P)下培养所得油脂样品进行分析，结果如表2所示，其中油酸(18∶1)含量最高，其次分别是棕榈酸(16∶0)和硬脂酸(18∶0)，这3种脂肪酸含量之和占总脂肪酸含量90%以上，这与Liu等[12]的研究成果相似，也与Wu等[9]此前研究的在不限制磷元素条件下的脂肪酸组成相似。同时，磷元素营养限制对油脂的脂肪酸组成影响较大：随着n(C)/n(P)的增加，饱和脂肪酸含量呈先下降后升高的趋势，且变化显著，当n(C)/n(P)为96、689和34 451时，饱和脂肪酸质量分数分别为45.2%、38.8%和65.5%。因此，磷元素调控还可作为一种调控脂肪酸组成的有效手段。

表2 不同碳磷摩尔比下弯曲隐球酵母脂肪酸组分

2.2 硫元素限制调控对弯曲隐球酵母产油影响

2.2.1 不同浓度的硫酸盐对弯曲隐球酵母生长及油脂量的影响

设置3种n(C)/n(S)培养基，通过添加不同量的Na2SO4，形成n(C)/n(S)分别为180、719和35 958的培养环境，其中n(C)/n(S)=180为对照组。经过121 h培养，弯曲隐球酵母生物量分别为18.8、13.0和6.6 g/L，随着硫元素的减少，生物量呈逐渐下降的趋势，说明硫元素缺乏时，不利于菌体繁殖，该趋势与磷元素限制相类似。胞内油脂含量随着硫元素的减少呈上升趋势，从16.2%上升到56.4%，说明硫元素限制能够促进弯曲隐球酵母中油脂含量的积累。油脂生产量及油脂得率均呈先上升后下降的趋势，由3.0 g/L (n(C)/n(S)=180)上升到6.0 g/L (n(C)/n(S)=719)再下降到3.8 g/L (n(C)/n(S)=35 958)，说明硫元素的适量限制可诱导菌体内的油脂生产，但是，过度的限制反而会对油脂的生产产生不良影响。

对发酵终点微生物菌体进行脂质体生物成像分析，结果如图2所示。在n(C)/n(S)为180(图2(a))的培养条件下，弯曲隐球酵母胞内含有较少的油脂，而随着n(C)/n(S)从719提高到35 958(图2(b)、(c))，微生物菌体内油滴状物质明显增多变大，该结果与油脂含量分析的结果吻合。

结果表明，弯曲隐球酵母在含低浓度Na2SO4的培养基中生长时，糖代谢流能选择性地转向油脂生物合成，然而过低浓度的硫元素限制不仅影响生物量的积累，还可能导致油脂生物合成途径中的必要条件受阻，影响油脂量积累及底物利用速率和效率。由此可知，在氮元素丰富的情况下，微弱的硫胁迫可作为一种有效调控油脂生产的方式。

表3 不同质量浓度Na2SO4条件下弯曲隐球酵母生长及产油结果

(a) ρ(Na2SO4)=2.0 g/L

(b) ρ(Na2SO4)=0.5 g/L

(c) ρ(Na2SO4)=0.01 g/L

图2C.curvatusATCC 20509在不同质量浓度的Na2SO4条件下微生物脂质体生物的成像结果

Fig.2 Liposomes results ofC.curvatusATCC 20509 at different Na2SO4concentrations

2.2.2 不同浓度的硫酸盐对弯曲隐球酵母油脂成分的影响

采用GC-MS对不同n(C)/n(S)培养条件下所得油脂样品进行分析，结果如表4所示，其中油酸(18∶1)含量最高，其次分别是棕榈酸(16∶0)和硬脂酸(18∶0)，这3种脂肪酸质量分数之和占总脂肪酸质量分数90%以上，这与Liu等[12]的研究成果相似。此外，实验结果还表明，硫元素限制对油脂的脂肪酸组成影响很大：饱和脂肪酸含量随着n(C)/n(S)的增加，呈先增加后减少的趋势，在n(C)/n(S)为180、719和35 958时，饱和脂肪酸质量分数分别为46.4%、60.8%和56.0%，该趋势与磷元素限制相反。说明硫元素限制对脂肪酸组成产生较大影响，有望通过对硫元素的调控直接调控菌油的脂肪酸组成。

表4 不同碳硫摩尔比下弯曲隐球酵母脂肪酸组分

3 结 论

采用磷元素和硫元素限制对弯曲隐球酵母的油脂积累进行调控。结果表明，提高培养基的n(C)/n(P) 或n(C)/n(S)均能够促进微生物的油脂积累。油脂含量和油脂得率随着n(C)/n(P)的增加而升高，随着n(C)/n(S)的增加先上升后下降。对脂肪酸组分进行分析表明，菌油中油酸含量最高，其次是棕榈酸和硬脂酸。n(C)/n(P)和n(C)/n(S)对脂肪酸的成分也产生影响，随着n(C)/n(P)的增高，饱和脂肪酸含量先下降后上升；而随着n(C)/n(S)的增高，饱和脂肪酸含量先上升后下降。因此有望通过对磷元素或硫元素的调控，直接调控菌油的脂肪酸组成。本研究为营养元素胁迫调控微生物转化甲壳素单体——N-乙酰-D-葡萄糖胺生产微生物油脂，提高其产量及改变油脂成分提供了依据，此外，该实验结果也为富氮生物质生产微生物油脂提供了新的思路和策略。

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Regulation of lipid accumulation from N-acetyl-D-glucosamine byCryptococcuscurvatusunder nutrition stress conditions

GAO Ning1,2, LIU Sasa1,2, BAO Ruiqi1,2, XIE Tongzhou1,2,JI Chaofan1,2, DONG Xiuping1,2, LIN Xinping1,2

( 1.School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China；2.National Engineering Research Center of Seafood, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China )

CryptococcuscurvatusATCC 20509 using N-acetylglucosamine as unique carbon source was used to investigate phosphorus and sulfate limitation impact on lipid accumulation, and fatty acid compositions were also analyzed by GC-MS. The results illustrated that both phosphorus and sulfur limitation could regulate lipid accumulation under nitrogen-rich condition. The lipid content and yield increased withn(C)/n(P) ratio increasing, while, increased initially and then decreased withn(C)/n(S) ratio increasing. The fatty acid analysis showed that the content of saturated fatty acid decreased first and then increased withn(C)/n(P) ratio increasing, while the content of saturated fatty acid increased first and then decreased withn(C)/n(S) ratio increasing.

Cryptococcuscurvatus; lipid; nutrition stress conditions

2016-09-29.

国家自然科学基金项目(3150100464)；中国博士后科学基金项目(2016M591419).

高 宁(1989-),女,硕士研究生；通信作者：林心萍(1985-),女,讲师.

TS222;Q815

A

1674-1404(2017)03-0157-05

高宁,刘洒洒,包汭琪,谢同舟,纪超凡,董秀萍,林心萍.营养胁迫调控弯曲隐球酵母转化N-乙酰-D-葡萄糖胺生产油脂[J].大连工业大学学报,2017,36(3):157-161.

GAO Ning, LIU Sasa, BAO Ruiqi, XIE Tongzhou, JI Chaofan, DONG Xiuping, LIN Xinping. Regulation of lipid accumulation from N-acetyl-D-glucosamine byCryptococcuscurvatusunder nutrition stress conditions[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(3): 157-161.