黄 莹万 斌黄振炎

健脾补肺膏对慢性阻塞性肺疾病小鼠模型的疗效※

黄 莹1万 斌2黄振炎3

目的探讨脾补肺膏治疗慢性阻塞性肺疾病（COPD）小鼠模型的临床疗效。方法将40只SPF级C57BL/6小鼠随机分为5组，分别为空白组、COPD模型组、健脾补肺膏高剂量组、中剂量组和低剂量组。除空白组外，其余小鼠均采用烟熏结合气管内脂多糖（LPS）滴入法制作COPD小鼠模型，待模型稳定后，空白组和模型组不予以药物治疗，健脾补肺膏高、中、低剂量组小鼠灌服健脾补肺膏溶液（给药浓度分别为20.8、10.4、5.2 ml/kg/d）。观察各小鼠精神状态、饮食情况、体重变化及大小便情况等，检测各组小鼠吸气阻力（RI）、肺静态顺应性、功能残气量（FRC）、趋化因子（KC）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）值。结果空白组和健脾补肺膏高剂量组小鼠体重随饲养周期增大，但健脾补肺膏高剂量组小鼠体重增加较缓慢，而其余 3组小鼠体重均有不同程度减轻；COPD模型组小鼠RI值、肺静态顺应性、FRC值较空白组均明显增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；健脾补肺膏高、中、低剂量组小鼠RI值、肺静态顺应性以及FRC值均较COPD模型组明显降低，且健脾补肺膏高剂量组小鼠RI值、肺静态顺应性以及FRC值均明显低于健脾补肺膏中、低剂量组，呈剂量依赖性，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；COPD模型组小鼠炎性细胞总数、IL-6、TNF-a、KC值较空白组均明显增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；健脾补肺膏高、中、低剂量组小鼠炎性细胞总数、IL-6、TNF-a、KC值均较 COPD模型组明显降低，且健脾补肺膏高剂量组小鼠炎性细胞总数、IL-6、TNF-a、KC值均明显低于健脾补肺膏中、低剂量组，呈剂量依赖性，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论健脾补肺膏方能显著增加COPD模型小鼠体重，改善肺功能，同时还能减轻炎性反应。

健脾补肺膏；慢性阻塞性肺疾病；肺功能；小鼠

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以持续性气流受限为特征的呼吸系统疾病，常与气道和肺组织接触烟雾等有害气体或有害颗粒，出现异常慢性炎症有关[1]。目前，临床针对 COPD主要以西医对症治疗为主，如应用支气管扩张剂、激素抗炎剂、祛痰药、免疫调节剂、抗氧化剂等，但单纯西药治疗难以改善肺功能，远期疗效较差。而中医疗法通过对COPD稳定期患者辨证施治，不但能减缓患者肺功能下降趋势，还能显著减少肺泡炎性因子产生、抑制气道重塑、调节机体免疫功能[2-3]。本研究就健脾补肺膏对COPD小鼠模型的疗效进行分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验动物SPF级C57BL/6小鼠，40只，8周龄，体重为20～22 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供（SCXK【京】2014-0004），符合国际动物伦理学标准。小鼠饲养于广州呼吸疾病研究所动物实验中心SPF级动物实验室（SYXK【粤】2011-0074），并按实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

1.2 实验试剂及药物脂多糖（LPS，美国 Sigma公司）；健脾补肺膏方（北黄芪300 g、党参250 g、茯苓200 g、白术200 g、百合200 g、苍术150 g、炙甘草100 g、法半夏100 g、干姜100 g、浙贝母150 g、北杏仁100 g、桔梗100 g、黄精150 g、川朴150 g、熟地黄150 g、山萸肉150 g、葶苈子150 g、生地黄150 g、当归100 g、怀山药200 g、知母150 g、泽兰150 g、川红花50 g、木香100 g、砂仁50 g、陈皮50 g、龟板胶150 g、阿胶150 g、冰糖200 g，由中山市中医院中药房提供）；红枚牌香烟（广东中烟工业有限责任公司）；肿瘤坏死因-a（TNF-a）、白细胞介素-6（IL-6）、趋化因子（KC）、酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海广锐生物科技有限公司）。

1.3 主要仪器及设备 FinePointeTMPET型小动物肺功能仪（美国Buxco公司）；自制熏烟箱（长宽高分别为50 cm、60 cm、90 cm）；BX 41TF型光学显微镜（日本电子株式会社）。

1.4 方法

1.4.1 制备健脾补肺膏 按照动物数量及给药时间计算药物剂量，取膏方组成药物加适量水浸泡 24 h后煎煮取汁，用脱脂棉和纱布过滤 3次，将滤液混合后浓缩至2000 ml左右，加入冰糖200 g炼制收膏。每1毫升膏剂含生药1.26 g，将膏方灭菌冷却后置于4 ℃冰箱中保存。

1.4.2 实验分组及COPD模型建立 将40只小鼠随机均分为空白组、COPD模型组、健脾补肺膏高剂量组、中剂量组和低剂量组，每组 8只。除空白组不进行COPD模型制备外，其余小鼠均需采用熏烟联合气道内LPS滴入法制作COPD稳定期小鼠模型。将各组小鼠（除空白组）分别置于熏烟箱中进行人为被动吸烟，熏烟时间为每天4次，上下午各2次，每次1小时（每次熏烟间隔15 min，上、下午间隔3～4 h，每小时10支香烟，每周6天），整个熏烟持续12周，在第1天和第14天向小鼠气管内注射LPS，剂量为7.5 μg/只。

药物用量按陈奇[4]提供的常用动物与人药物剂量换算公式计算，模型制备完成后，健脾补肺膏高、中、低剂量组灌服健脾补肺膏溶液（给药浓度分别为20.8、10.4、5.2 ml/kg/d）。整个实验持续4个周期（4周），每个周期完成后均需测量小鼠体重[5-7]。

1.4.3 一般行为观察 观察各小鼠精神状态、饮食情况、体重变化及大小便情况等。

1.4.4 肺功能测定 治疗 4周后，测量各组小鼠肺功能，包括吸气阻力（RI）、肺静态顺应性及功能残气量（FRC）。具体操作如下：于小鼠腹腔注射 1%戊巴比妥钠（空白组按100 mg/kg，其余各组小鼠按70 mg/kg）进行麻醉采用，于颈部甲状腺处切开气管，气管插管，连接小动物通气机进行机械通气，设定潮气量10 ml/kg，吸气压力为8～12 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa），每分钟呼吸120次，吸呼比10:15，待图形稳定后，开始测定肺通气功能。

1.4.5 肺泡灌洗液中炎性细胞数目以及TNF-a、IL-6和KC值测定 小鼠麻醉后，暴露气道，予以留置针气管内插管结扎，再用加EDTA的PBS缓冲液冲洗支气管肺泡，回收肺泡灌洗液，得到的灌洗液在每分钟1500 r条件下离心10 min（离心半径15 cm），完成后收集上清液保存于-80 ℃冰箱中。向剩余的沉淀中加入红细胞裂解液 200 μl混匀，常温下反应3～5 min，离心弃上清，加入PBS缓冲液1 ml，混匀，取10 μl于细胞计数板上行细胞计数[8-9]。最后，-80 ℃保存的上清液使用ELISA试剂盒测定TNF-a、IL-6和KC值。

1.5 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，组间比较采用F检验，两两比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般行为观察空白组和健脾补肺膏高剂量组小鼠精神状态良好，毛发顺滑干净有光泽，体重随饲养周期增大，但健脾补肺膏高剂量组小鼠体重增加较缓慢，而其余3组小鼠体重均有不同程度减轻；另外，模型组小鼠与其他组小鼠相比，精神状态较差，行动迟缓，呼吸急促，毛发缺少光泽，局部脱落，进食量减少。见表1。

表1 各组小鼠治疗前后体重比较(g,±s)

表1 各组小鼠治疗前后体重比较(g,±s)

组别 只数 0周 1周 2周空白组 8 22.4±1.3 24.8±0.9 26.4±1.1 COPD模型组 8 22.9±1.5 21.7±1.1 20.8±0.8高剂量组 8 22.1±1.0 22.3±1.3 22.7±0.7中剂量组 8 21.7±1.3 21.8±1.5 21.4±1.8低剂量组 8 22.6±0.7 22.3±1.1 21.9±0.8组别 只数 3周 4周空白组 8 27.8±1.4 29.6±1.5 COPD模型组 8 20.1±0.6 19.6±1.2高剂量组 8 23.1±0.8 24.6±1.7中剂量组 8 21.7±0.9 21.5±1.1低剂量组 8 21.6±1.0 21.1±1.6

2.2 治疗后各组小鼠肺功能改变COPD模型组小鼠RI值、肺静态顺应性、FRC值较空白组均明显增高，差异均有统计学意义（均 P＜0.05）；健脾补肺膏高、中、低剂量组小鼠RI值、肺静态顺应性以及FRC值均较COPD模型组明显降低，且健脾补肺膏高剂量组小鼠RI值、肺静态顺应性以及FRC值均明显低于健脾补肺膏中、低剂量组，呈剂量依赖性，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见图1。

图1 治疗后各组小鼠肺功能改变

2.3 治疗后各组小鼠肺泡灌洗液中炎性细胞总数及各因子表达量比较COPD模型组小鼠炎性细胞总数、IL-6、TNF-a、KC值较空白组均明显增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；健脾补肺膏高、中、低剂量组小鼠炎性细胞总数、IL-6、TNF-a、KC值均较COPD模型组明显降低，且健脾补肺膏高剂量组小鼠炎性细胞总数、IL-6、TNF-a、KC值均明显低于健脾补肺膏中、低剂量组，呈剂量依赖性，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

表2 治疗后各组小鼠肺泡灌洗液中炎性细胞总数及各因子表达量比较(±s)

表2 治疗后各组小鼠肺泡灌洗液中炎性细胞总数及各因子表达量比较(±s)

组别 只数 细胞总数计数(109/L) IL-6 (pg/ml) KC (pg/ml) TNF-a (nmol/L)空白组 8 16.2±1.8 7.5±0.9 45.5±1.2 33±3模型组 8 136.3±19.7 19.6±2.5 157.5±8.8 86±10高剂量组 8 37.5±1.5 10.2±1.1 66.4±6.8 56±7中剂量组 8 58.4±3.8 12.6±1.1 76.5±9.5 68±8低剂量组 8 89.8±6.4 16.1±2.0 96.2±7.2 76±8

3 讨论

COPD不仅累及肺，也可以引起显著全身反应。目前，COPD居全球病死原因第四位，世界卫生组织公布，至2020年COPD将位居世界疾病经济负担的第五位[10]。我国最新统计数据显示，全国约4000万COPD患者，40岁以上人群COPD患病率为8.2%，每年因 COPD病死人数达100万人，致残人数达500～1000万人，COPD居我国疾病负担首位，给患者及其家庭、社会带来沉重经济负担[11]。CPOD发病机制仍有很大争议，目前炎性细胞释放多种细胞因子和炎性介质在气道炎症中起重要作用的观点得到越来越多人的认同，其中包括IL-6、KC及TNF-a[12]。慢性炎性反应可诱发肺实质损伤（产生肺气肿），造成小气道纤维化。这些改变可导致气体陷闭和进行性气流受限，诱发呼吸困难和COPD其他症状。西医对COPD的治疗包括药物治疗、机械通气、康复治疗及自我管理等综合措施[13-14]。西医针对 COPD患者，一般予以规律剂量的短效支气管扩张剂，同时辅以吸氧、抗菌药物、糖皮质激素及无创或有创正压通气等治疗，但治疗效果并不理想。中医治疗COPD方法多样，如针灸、推拿（穴位按摩）、中药穴位贴、中药雾化吸入、中药支气管肺泡灌洗、中药灌肠等外治法，对COPD均有较好的疗效。

COPD在中医病名中属于“咳嗽”“肺胀”等范畴，辨证属本虚标实之证，本虚主要为肺、脾、肾三脏之虚，早期多为肺气虚，继而累及脾肾，致肺、脾、肾三脏俱虚；标实则为痰、热、瘀交互错杂致病，病情迁延难愈，其稳定期又以肺脾肾虚衰为主[15]。中医认为，COPD稳定期的病机特点为外邪已去，本病病位首先在肺，继则影响脾肾，后期病及于心；由于久病耗气，肺气不利，不能正常宣发肃降，肺气上逆而致咳嗽。肺金为脾土之子，久病肺气亏虚，子盗母脾主肌肉，久则致脾气亏虚，不能正常输布津液，聚而成痰，上归于肺而成浊痰，即《医宗必读•痰饮》“脾土虚湿，清者难升，浊者难降，流中滞膈，郁而成痰”之谓。痰贮于肺，阻碍气机，气机不畅则发咳嗽、咳痰、胸胀满、气短。反之，脾气虚弱，运化失常，土不生金，致肺气更虚。因此，在稳定期，应充分发挥中医培本固元的优势，培土以生金以助生化之源，可有效改善患者营养不良状态、提高抗邪复元能力，从而延缓肺功能下降。本研究立足于COPD稳定期肺脾两虚特点，选用陈夏六君子汤为主方研制的健脾补肺膏方，甘温益气而不碍邪，行气化滞而不伤正，使脾气充盈而运化复健，湿浊去而痰滞渐，全方起健脾肺、补肾纳气化痰止咳之效[16]。

本研究结果表明，健脾补肺膏方能显著增加COPD模型小鼠体重，改善肺功能，同时还能减轻炎性反应。RI值增高，说明气道不完全可逆性狭窄；Cchord值增大，说明肺组织弹性下降。另外，COPD稳定期给予中医治疗，除了能减少患者COPD急性发作的次数以外，还能有效改善患者营养不良状态、提高抗邪复元能力，增强抵抗力，从而从根本缓解COPD急性加重，延缓患者肺功能下降。本研究使用的膏方制作简单，解决了患者长期煎服中药的困扰，使患者用药更方便，利于患者长期坚持服用。

综上所述，本实验通过健脾补肺膏治疗 COPD稳定期小鼠模型，一定程度上对COPD疾病的进展起到了良好的干预作用，同时各种检测结果也均与该病临床治疗结果相符。所以，本研究的进行为COPD稳定期的早期临床治疗及基础研究提供一个可靠的新方法。

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The effect of Jianpi tonifying lung paste on mice with chronic obstructive pulmonary disease

Huang Ying Wan Bin Huang Zhenyan

ObjectiveTo investigate the clinical effect of spleen tonifying lung paste in treating chronic obstructive pulmonary disease in mice.Methods40 SPF C57BL/6 mice were randomly divided into 5 groups,namely control group,COPD model group,jianpibufei ointment in high dose group,middle dose group and low dose group,except the blank group,the remaining mice were exposed to tobacco smoke by intratracheal instillation of lipopolysaccharide (LPS) COPD mice model,to be the model is stable,not to the blank group and the model group medication,jianpibufei cream high in the low dose group of mice orally jianpibufei paste solution(drug concentration were 20.8,10.4,5.2 ml/kg/d).To observe the mice mental state,diet,body weight changes and urine,were detected inspiratory resistance(RI), static pulmonary compliance,functional residual capacity (FRC),chemokine(KC),tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and interleukin-6 (IL-6) value.ResultsThe blank group and the weight of spleen and lung extract high dose group of mice with feeding period increase,but jianpibufei ointment in high dose group mice increased more slowly, while the remaining 3 groups of mice had different degrees of weight loss;COPD model group,RI value,static lung compliance,FRC values were significantly higher than the control group,the difference there was statistically significant (P＜0.05);jianpibufei paste,high medium and low dose group of mice RI,static lung compliance and FRC were significantly higher than COPD model group decreased,and jianpibufei ointment in high dose group of RI value,staticlung compliance and FRC value were significantly lower than that of tonifying spleen lung extract medium and low dose group,dose dependently,the differences were statistically significant(P＜0.05);COPD model group,the number of inflammatory cells,IL-6,TNF-a,KC values were significantly higher than the control group,the differences were statistically significant(P＜0.05);jianpibufei paste,high medium and low dose group of mice the number of inflammatory cells,IL-6, TNF-a,KC values were lower than COPD model group decreased obviously,and jianpibufei ointment in high dose group of total inflammatory cells,IL-6,TNF-a,KC values were significantly lower than that of jianpibufei ointment in the low dose group,dose dependently,the differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionInvigorating spleen and tonifying lung paste can significantly increase the body weight of COPD mice,improve lung function,but also reduce the inflammatory response.

Jianpibufei Gao;Chronic obstructive pulmonary disease;Pulmonary function;Mice

10.12010/j.issn.1673-5846.2017.05.011

1广州中医院大学附属中山中医院，广东中山 528400

2广州医科大学附属第一医院，广东广州 510120

3广州呼吸病研究所国家呼吸疾病重点实验室，广东广州 510120

2016年中山市卫生和计划生育局课题（编号：2016J082）