金 笑， 寇文伯， 于昊天， 刘亚军， 马燕天， 吴 兰

南昌大学生命科学学院, 鄱阳湖环境与资源利用教育部重点实验室， 江西 南昌 330031

鄱阳湖不同区域沉积物细菌群落结构、功能变化及其与环境因子的关系

金 笑， 寇文伯， 于昊天， 刘亚军， 马燕天， 吴 兰*

南昌大学生命科学学院, 鄱阳湖环境与资源利用教育部重点实验室， 江西 南昌 330031

为了解鄱阳湖湖区内具有不同形态、功能的沉积物微生物群落的空间差异，采用T- RFLP(末端限制性片段长度多态性)和Biolog- Eco微平板法，对松门山(主湖区)、饶河(入湖口)、南矶山(碟形湖)和白沙洲(湖汊)样地表层沉积物进行细菌遗传多样性和微生物代谢功能多样性进行分析．结果表明：鄱阳湖具有不同形态、功能的样地间细菌群落结构及微生物功能多样性存在协同的空间异质性，显示饶河样地与其他样地之间差异显著(P<0．05)．基于T- RFLP结果，饶河样地与其他样地细菌群落结构的差异主要来源于中等相对丰度(0．20%～2．00%)的TRFs片段．此外，饶河样地微生物代谢活性显著低于其他样地(P<0.05)，主要是因为饶河样地微生物对多聚物类和碳水化合物类碳源的利用能力显著降低．基于微生物群落与环境因子的冗余分析(RDA)结果显示，营养物质(有机质、TOC、TN)和重金属(Zn)是影响细菌群落结构的主要因子，而水深、pH、速效氮〔w(NH4+-N)、w(NO3--N)〕、重金属〔w(Zn)、w(Cu)、w(Cd)〕是影响微生物代谢多样性的显著因子．研究显示，重金属(Zn)对鄱阳湖沉积物细菌群落结构及微生物功能多样性具有显著影响．研究结果可为探索大型淡水湖泊底栖微生物群落结构和功能的空间异质性以及探讨微生物群落结构与功能对环境因素的响应提供理论依据．

鄱阳湖； Biolog-Eco微平板法； T-RFLP分析； 微生物代谢功能； 细菌群落结构

近年来，随着对淡水资源需求量的增加以及对水资源的不合理利用，淡水湖泊的水环境安全日益成为国内外学者十分关注的环境问题[1- 2]．在淡水湖泊生态系统中，表层沉积物是微生物聚居和生源物质赋存的主要介质，而微生物可以通过同化、异化等代谢过程来影响沉积物中营养盐及重金属的分布、转化、利用等[3- 5]．因此，湖泊沉积物微生物群落可作为水环境变化和演替的重要标志．研究淡水湖泊沉积物中的微生物群落对环境因子的响应规律，并揭示其结构与功能的联系，对了解淡水湖泊水环境中生源要素的循环具有重要作用．

目前，有诸多学者进行了依赖于地理距离的沉积物细菌群落差异比较，这种差异主要受到了气候、地质背景、水文特征以及来自于湖体及集水区人为因素的影响[6- 8]，水体环境的变化和外来物质的输入都会影响沉积物中的细菌群落结构[9]．如Macalady等[10]对美国加利福尼亚州受到无机汞污染的克里尔莱克湖中3个不同区域进行研究，发现其沉积物细菌群落结构与采样区域密切相关，在高汞区域演替出的类脱硫杆菌微生物在沉积物汞甲基化过程中发挥了重要作用．此外，研究表明，营养物质会对微生物代谢功能活性起到促进作用[11]，而在重金属污染区域进行的研究中，重金属浓度升高对微生物代谢功能活性的作用呈现先促进后抑制的规律[12]．然而，以往对细菌群落的研究大多是建立在单一类型的环境因素对微生物群落的影响方面，对于具有复杂性生境的大型淡水湖泊来说，单一类型环境因素的改变并不足以反映微生物对环境的响应特征，因而其研究还远远不足．除此之外，依据杜萍等的研究[13- 15]，在环境改变的条件下，微生物群落结构与功能的关系分别呈现协同、功能优先于结构以及结构优先于功能变化的特征．由此可见，湖泊底泥微生物群落结构和功能如何响应环境变化并没有得到一致性的答案．

鄱阳湖地处江西省北部、长江中下游南岸，是我国第一大淡水湖．鄱阳湖湖河形态多样，除了主湖区以及出入湖河流外，还有许多人控或天然湖汊和碟形湖等．作为长江洪水的天然调蓄场所，鄱阳湖同样也是生物多样性的重要区域，为人类提供了丰富的淡水以及鱼类资源，是广大湖区人民赖以生存发展的重要基础[16]．该研究选取鄱阳湖湖区范围内4个形态及功能差异明显的样地——松门山(主湖区)、南矶山(碟形湖)、饶河(入湖口)、白沙洲(湖汊)，利用T-RFLP(末端限制性片段长度多态性)和Biolog-Eco微平板技术，从群落结构和代谢活性两方面进行鄱阳湖沉积物微生物群落结构和功能的空间变化研究，探索湖泊底栖微生物与环境因子的响应关系，以期为进一步探讨生态环境的地域变化提供理论依据．

1 材料与方法

1．1 样品采集与处理

于2014年3月在鄱阳湖4个样地(见图1)进行沉积物微生物群落结构及功能的调查研究，4个样地分别为松门山(SMS，29°12′N、116°11′E)、南矶山(NJS，28°55′N、116°16′E)、饶河(RH，29°01′N、116°29′E)和白沙洲(BSZ，29°10′N、116°37′E)．松门山样地地处鄱阳湖南主湖区，湖面开阔，水流平稳；南矶山样地为碟形湖，环境相对封闭，枯水期与主湖区分离，有大量的渔业养殖活动；饶河样地为入湖口，湖水流速快，并且受到上游来水影响显著；白沙洲样地为湖汊，长期受到旅游业等人为影响．每个样地设置3个平行采样点，分别分布在湖(河)中央以及向两侧延伸200～500 m位置．沉积物样品的采集采用抓斗式采泥器，同时进行水深等原位参数的测定．样品采集后，立即放入无菌的聚乙烯自封袋中，于冰上放置并迅速运回实验室．将每份样品一分为二：一份于4 ℃下保存，用于理化指标以及微生物群落功能多样性的测定；另一份装入无菌离心管中保存于-80 ℃冰箱，用于细菌群落结构分析．样品采集及处理过程尽可能在无菌条件下进行．

样地：1—松门山(主湖区)；2—南矶山(碟形湖)；3—饶河(入湖口)；4—白沙洲(湖汊)．图1 鄱阳湖样地分布Fig．1 Sampling sites in the Poyang Lake

1．2 理化参数测定

样品pH以及AFDM(去灰分干质量，用以表征有机质含量)、w(NO3--N)、w(NH4+-N)、w(TP)、w(TN)、w(TOC)测定方法见文献[17]；w(Cu)、w(Zn)、w(Pb)、w(Cd)采用原子吸收分光光度法[18](AA800型圆原子吸收分光光谱仪，美国PE公司)进行测定．

1．3 沉积物微生物总DNA的提取及T- RFLP分析

称取-80 ℃下保存的沉积物样品0．3 g，采用LU等[19]所运用的方法进行沉积物总DNA的提取．采用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCWGC- 3′)和1392R(5′-ACGGGCGGTGTGTACA- 3′)[20]进行16S rDNA PCR扩增，上游引物5′端进行6-FAM荧光标记(生工生物工程(上海)股份有限公司).

将PCR扩增产物用限制性内切酶HaeⅢ进行酶切．酶切产物经纯化(Cycle-Pure Kit，OMEGA)后，进行STR微卫星检测(生工生物工程(上海)股份有限公司)．

T-RFLP分析过程[20]：经STR微卫星检测得到TRFs图谱，舍去低于50 bp和高于600 bp长度的片段．计算每一种片段的相对丰度，并舍去各样品中相对丰度小于0．5%的片段．

1．4 Biolog-Eco微平板技术

对沉积物细菌功能多样性的分析方法见文献[21]，用AWCD(average well color development，平均颜色变化率)来评判微生物群落的碳源利用能力，指示微生物群落的代谢活性，其计算公式：

式中：Ri为第i个非对照孔的吸光值；R0为对照孔的吸光值；31表示有31种碳源．

1．5 数据分析

根据TRFs在不同样品图谱中的分布及丰度，采用PC- ORD 5．0软件进行Heatmap分析，并利用Venny 2．1．0(http：bioinfogp．cnb．csic．estoolsvennyindex．html)进行韦恩图的绘制．采用CANOCO 5．0对T- RFLP分析结果及培养72 h的碳源利用结果结合环境因子进行冗余分析(RDA)．采用PRIMER 5．0进行分类组间细菌群落结构及功能差异的ANOSIM分析，并对引起差异的主要类群及碳源进行Simper分析．采用SPSS 20．0软件进行环境参数的差异性检验及碳源与环境因子的相关性分析，显著性水平设置为0．05．

2 结果与分析

2．1 鄱阳湖沉积物理化性质及重金属含量

鄱阳湖不同样地沉积物理化因子及重金属含量见表1．结果显示，除w(TOC)和w(Pb)外，沉积物其他理化因子及重金属质量分数在不同样地间均差异显著(P<0．05)．鄱阳湖沉积物pH为5．67～6．63，属弱酸性．各营养参数均在松门山样地最低，与碳、氮相关的参数均在南矶山样地最高，w(TP)在饶河样地最高．4种重金属含量均在饶河样地最高，松门山和南矶山样地最低．利用地积累指数法并参照鄱阳湖土壤重金属背景值[22]对重金属含量进行生态污染评价，结果显示，Pb在4个样地中均无污染，其他3种重金属的污染程度表现为Cu>Zn>Cd．

2．2 细菌群落多样性及其与环境因子的相关性

对鄱阳湖4个样地沉积物样品进行微卫星检测，共获得的TRFs数目为52～67，表明鄱阳湖沉积物细菌群落结构均具有较高的多样性．

为了分析鄱阳湖沉积物细菌群落结构的空间变化，进行了样地之间的Heatmap聚类分析(见图2)及ANOSIM分析．结果表明，沉积物细菌群落在4个样地间差异显著(P<0．05)．所有样品聚为两支，饶河样地与其他样地细菌群落结构相似性最小，单独为一支；其他样地聚为一支，其中南矶山样地与白沙洲样地细菌群落结构相似性最高，约为37%．由此可见，鄱阳湖沉积物中饶河入湖口样地细菌群落结构显著不同于其他样地，而南矶山碟形湖和白沙洲湖汊样地中的细菌群落结构更为相似．

通过对鄱阳湖沉积物中各种TRFs片段的相对丰度进行计算，得到细菌群落组成的韦恩图(见图3)．由图3可知，共有24种TRFs广泛分布于鄱阳湖沉积物样品中，占所有TRFs片段的87%，这24种TRFs中的8种(TRF77、TRF600、TRF356、TRF572、TRF270、TRF370、TRF537和TRF288)在4个样地中均处于优势地位(相对丰度均大于2%，下同)．此外，TRF251(1．20%)、TRF394(0.70%)、TRF555(0．80%)、TRF589(1．40%)均分布于南矶山、白沙洲和松门山样地却不存在于饶河样地中，同时TRF108(0．07%)、TRF127(0．04%)、TRF444(0．04%)、TRF497(0．04%)4种TRFs片段只存在饶河样地而不存在其他样地中．进而进行Simper分析以了解造成饶河样地与其他样地细菌群落差异的主要物种组成，结果显示，TRF573(1．6%)、TRF588(0．96%)、TRF576(1．20%)、TRF589(1．47%)、TRF571(1．92%)起到了关键作用，关键作用，并且在饶河样地的相对丰度显著高于其他样地(P<0．05)．综上可知，饶河样地与其他样地细菌群落结构的差异主要来源于某些处于中等相对丰度(0．20%～2．00%)片段在样地之间的丰度差异，而不是片段的独有或缺失．

注： 不同的数字代表TRFs片段个数．图3 基于T- RFLP结果的韦恩图Fig．3 Venn Diagram based on the T-RFLP analysis

为了解鄱阳湖沉积物环境因子与细菌群落的关系，进行了冗余分析，结果见图4．由Monte Carlo检验可知，w(TN)(F=3．2，P=0．002)、AFDM(F=2．1，P=0．006)、w(TOC)(F=16．8，P=0．022)和w(Zn)(F=1．9，P=0．042)是对细菌群落具有显著影响的环境因子，并且冗余分析排序图中前两个排序轴共解释了34．38%的变异，表明除了已知环境因子外，可能还有其他因素对鄱阳湖沉积物细菌群落的分布具有较大影响．在以上四种参数所确定的二维空间内，各样地区域相互独立．值得注意的是，饶河样地细菌群落结构主要受w(Zn)的影响；与此相比，南矶山样地细菌群落结构主要受营养参数〔AFDM、w(TOC)和w(TN)〕的影响．

注： RH-A、 RH-B、 RH-C分别代表饶河样地的3个平行采样点， 其他依次类推．图4 基于T- RFLP的细菌群落与环境因子的冗余分析Fig．4 RDA analysis of bacterial communities and physiochemical parameters based on T-RFLP

2．3 细菌功能多样性及其与环境因素的相关性

为了解沉积物微生物群落功能多样性，利用Biolog-Eco微平板对微生物利用碳源的能力进行分析，每隔12 h测定其AWCD值，绘制其随时间变化的动态曲线，结果如图5所示．由图5可见，鄱阳湖沉积物微生物群落利用碳源的AWCD值随着培养时间的增加而逐渐升高，0～36 h各样地的AWCD值较低，表明处于代谢延迟期，>36～96 h为对数生长期，>96 h后为代谢稳定期．结果显示，饶河样地微生物碳源利用能力显著低于其他样地(P<0．05)，并且南矶山、松门山和白沙洲沉积物微生物群落的代谢能力之间无显著差异(P>0．05)．

图5 不同样地微生物群落的AWCDFig．5 AWCD of the sediment microbial community in different sites

注： 不同小写字母代表不同样地间差异达到P<0．05显著水平．图6 培养72 h时不同样地土壤微生物群落对6种不同类型碳源的利用能力Fig．6 The ability of the sediment microbial community to utilize six types of carbon source after 72 hours′ cultivation

Biolog-Eco微平板中含有六大类碳源，共计31种．通过分析沉积物微生物对6种不同碳源的利用能力，能够反映微生物的功能代谢类群，培养72 h时的测定结果如图6所示．由图6可见，总体上鄱阳湖沉积物细菌群落对六大类碳源的利用能力表现为胺类>氨基酸类>酚酸类>羧酸类>多聚物类>碳水化合物类．不同样地间微生物对六大类碳源的利用能力差异显著(P<0．05)，并表现出不同的变化规律．微生物群落利用碳水化合物类、羧酸类、氨基酸类、胺类碳源的AWCD值均在松门山样地最高，而其利用多聚物类和酚酸类碳源的AWCD值在白沙洲样地最高，说明松门山样地和白沙洲样地微生物群落具有最强的碳源利用水平．微生物群落利用多聚物类和碳水化合物类碳源的AWCD值在饶河样地最低，而其利用羧酸类、酚酸类、氨基酸类和胺类碳源的AWCD值在南矶山样地最低．整体上，鄱阳湖沉积物微生物群落对胺类、氨基酸类、酚酸类、羧酸类碳源的利用高于多聚物类和碳水化合物类碳源，但是饶河样地微生物群落对多聚物类和碳水化合物类的利用相比其他样地显著降低．

为了进一步了解鄱阳湖沉积物环境因子与微生物群落功能多样性的关系，利用培养72 h后微生物对各种碳源利用的AWCD值进行冗余分析，结果如图7所示．结果表明，w(NH4+-N)(F=3．5，P=0．016)、pH(F=3．4，P=0．014)、w(NO3--N)(F=3．4，P=0．01)、水深(F=3．2，P=0．018)、w(Zn)(F=2．7，P=0．032)、w(Cu)(F=2．3，P=0．028)、w(Cd)(F=2．3，P=0．038)是影响细菌群落功能多样性的主要因子，前两轴共解释了60．61%的变异．

× 饶河样地 ● 南矶山样地 ▲ 松门山样地 ■ 白沙洲样地图7 基于Biolog- Eco微平板技术的细菌群落功能与环境因子的冗余分析Fig．7 Redundancy analysis of bacterial communities function and physiochemical parameters based on Biolog-Eco plate

饶河样地细菌群落功能主要受到w(Cu)、w(Zn)、w(Cd)的影响，而南矶山样地主要受到w(NO3--N)和w(NH4+-N)的影响，松门山样地主要受到水深和pH的影响，而白沙洲样地受各种参数影响均较小．根据Pearson相关性分析(数据未列出)可知，微生物对多聚物类和碳水化合物类碳源的利用主要与重金属含量呈显著负相关(P<0．05)，故多聚物类和碳水化合物类可能是引起饶河样地与其他样地微生物代谢功能差异的主要代谢底物．

3 讨论

3．1 鄱阳湖沉积物细菌群落结构及微生物功能多样性的空间变化

该研究结果表明，鄱阳湖沉积物细菌群落结构及功能多样性在各样地间具有较高的空间异质性，并且群落结构和功能呈现协同变化规律，均表现为饶河样地与其他样地之间差异显著．Franklin等[23]在2．5～11 m的较小尺度下得到微生物物种相似度随距离增加而显著降低的空间格局；而王佳等[24]在20～200 km的相对较大尺度下，对浑河沉积物进行研究时也发现，从上游到下游沉积物细菌群落结构具有明显的区域分布特征，呈现由单一向复杂演替的趋势；此外，在其他一些研究中，微生物的某些物种或为了适应环境的变化而表现出不同的功能模式，使得结构的变化延迟于功能的变化[14]，或因环境改变而演替出其他具有相同功能的微生物类群，使得微生物功能变化延迟于结构变化[15]．因此，淡水湖泊表层沉积物微生物群落结构和功能变化是否协同发生、如何协同发生及发生机制还需要更多的研究证明．

针对基于T-RFLP得到的细菌群落结构结果进行Simper分析可知，在对饶河样地与其他样地的差异中起主导作用的是中等相对丰度(0．20%～2．00%)的TRFs片段，而沉积物中的优势和稀有TRFs片段对细菌群落结构变化的影响较小[9]．结果显示，鄱阳湖沉积物中等相对丰度的微生物类群可能能够执行一些更加专有的功能，而优势类群可能因含有更多的功能冗余而无法在样品差异中得以体现[25]．秦红灵等[26]运用T-RFLP技术对不同土地利用方式下土壤细菌群落结构进行研究时也发现，除了优势片段外，某些相对数量较少的TRFs片段受土地利用方式的影响也较大．表明在对细菌群落结构进行空间异质性的研究过程中，对各种丰度类群的变化关注不能忽视．

Biolog-Eco微平板技术可以有效地评价不同空间水平上同一环境区系中菌群功能的变化特征[27]．饶河地区微生物对多聚物类及碳水化合物类碳源的利用能力显著低于其他样地，表明这两类碳源可能是导致鄱阳湖沉积物空间代谢差异的主要碳源．有研究表明[28]，在具有不同重金属污染程度的矿区土壤中，其微生物群落的碳源代谢差异是由碳水化合物类碳源导致的．也有研究[29]表明，低剂量Cu添加能提高微生物群落对多聚物类碳源的转化与利用的能力．由此可见，微生物对多聚物和碳水化合物类碳源利用的变化可以作为沉积物重金属含量变化的灵敏、有效的生物学指标．

3．2 环境因子对湖泊沉积物细菌群落结构与微生物代谢功能的影响

营养物质〔AFDM、w(TN)、w(TOC)〕及重金属w(Zn)是细菌群落结构的显著影响因子，而水深、pH、速效氮〔w(NH4+-N)、w(NO3--N)〕、重金属〔w(Zn)、w(Cu)、w(Cd)〕是微生物代谢功能多样性的显著影响因子．并且w(Zn)是造成饶河样地与其他样地微生物群落结构(解释量16．1%)和功能(解释量21．4%)差异的共同环境因子．已有研究[30- 31]证实，较低的w(Zn)能够促进微生物生长，而较高的w(Zn)则会对微生物生长产生毒害作用．此外，该研究表明，重金属w(Cu)、w(Cd)对细菌群落结构的影响不显著，但却显著影响微生物代谢功能，这可能是微生物对重金属长期适应的结果[32]．同时，饶河样地的复合高重金属含量对微生物代谢有一定程度的抑制作用，与TENG等[33]对Ag尾矿区重金属复合污染土壤微生物群落研究结果相符．该研究中，w(TP)也呈现出饶河样地显著高于其他样地的特征，但通过Monte Carlo检验，w(TP)并不是影响其细菌群落的显著影响因子，由此可见，在重金属和磷同时污染时，淡水湖泊沉积物微生物的群落结构和功能对重金属变化更为敏感[34]．

4 结论

a) 鄱阳湖沉积物中，除w(TOC)和w(Pb)外，所测定的其他理化参数及重金属含量在形态及功能不同的样地间均具有显著的空间差异．

b) 鄱阳湖沉积物细菌群落结构及微生物的碳源利用能力在各样地间呈现协同变化特征．其中饶河样地的细菌群落与其他样地差异最大，在细菌群落结构上主要体现在中等相对丰度TRFs片段在不同样地间的丰度差异；而饶河样地微生物的碳源代谢能力显著低于其他样地，主要是由于微生物对多聚物类和碳水化合物类碳源的利用能力显著降低所致．

c) 鄱阳湖沉积物细菌群落结构及功能多样性受环境因子的影响较大，其中细菌群落结构多样性受到营养物质〔AFDM、w(TN)、w(TOC)〕及重金属w(Zn)的显著影响，而微生物的碳源利用功能多样性受到水深、pH、速效氮〔w(NH4+-N)、w(NO3--N)〕、重金属〔w(Zn)、w(Cu)、w(Cd)〕的显著影响．

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Environmental Factors Influencing the Spatial Distribution of Sediment Bacterial Community Structure and Function in Poyang Lake

JIN Xiao， KOU Wenbo， YU Haotian， LIU Yajun， MA Yantian， WU Lan*

School of Life Sciences， Key Laboratory of Poyang Lake Environment and Resource， Ministry of Education，Nanchang University， Nanchang 330031， China

This study aimed to explore the spatial distribution patterns of bacterial community structure and metabolic function in the surface sediments of Poyang Lake using the T-RFLP and Biolog-Ecoplate．Sediment samples were selected from four sites：Songmenshan(SMS)，Nanjishan(NJS)，Baishazhou(BSZ)and Raohe(RH)．The results demonstrated that both the bacterial community structure and function from RH were significantly different from the other sites(P<0．05)，suggesting a similar spatial variation in both bacterial community and microbial metabolic functions．The T-RFLP fragments with a relative abundance between 0．20%-2．00% mainly contributed to the differences of bacterial community composition among the four sites．Meanwhile，the average well color development(AWCD)used to characterize the microbial carbon metabolic activity of the Raohe samples(AWCD=0．65)was remarkably lower than the other sites(P<0．05)；further analysis attributed this decrease to the reduced utilization of polymers and carbohydrates．Redundancy analysis(RDA)results showed that nutrient parameters(i．e．，organic matter，TN and TOC)and heavy metal Zn obviously affected the bacterial community structure，while water depth，pH，available nitrogen(i．e．，NH4+-N，NO3--N)and heavy metals(i．e．，Zn，Cu and Cd)had significant effects on the microbial carbon metabolic function．Overall，heavy metal Zn was the most important factor that shaped the bacterial community structure and microbial carbon metabolic function of lake sediments．This study may give insight into the spatial heterogeneity and environmental effects on sediment microbes in large freshwater lakes．

Poyang Lake； Biolog- Ecoplate； T- RFLP； microbial metabolic function； bacterial community structure

2016- 10- 08

2016- 11- 29

国家自然科学基金项目(31360127，31060082，31660027)

金笑(1990-)，女，山东烟台人，ncusk724@hotmail．com．

*责任作者，吴兰(1969-)，女，江西萍乡人，教授，博士，博导，主要从事环境微生物学研究，wl690902@hotmail．com

X172

1001- 6929(2017)04- 0529- 08

A

10．13198j．issn．1001- 6929．2017．01．51

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