张驰 陈倩莹 赵雅静 高雳 赵川江

Notch通路对牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导人牙周膜细胞表达RANKL/OPG的影响*

张驰 陈倩莹 赵雅静 高雳 赵川江

目的：探讨牙龈卟啉单胞菌(Porphy romonas gingivalis，Pg)脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激人牙周膜成纤维细胞(human periodon tal ligam ent cells，hPDLCs)后Notch信号通路的表达及其对RANKL/OPG表达的影响。方法：酶消化法结合组织块法原代培养hPDLCs，取第三代至第五代细胞给予0．1、1、10μg /m l Pg-LPS刺激72h，Real-time PCR检测RANKL/OPG m RNA的表达，并选择最佳诱导浓度1μg/m l组，采用Real-time PCR检测Notch通路Notch1-2、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL-1以及Hey-1表达受体配体及目的基因表达。随后，以γ-分泌酶抑制剂DAPT预处理hPDLCs 1h，予1μg /m l Pg-LPS刺激72h后，Real-tim e PCR、W estern-B loting检测Notch通路目的基因Hey-1及RANKL/OPG m RNA、蛋白水平的表达。结果：1μg/m l Pg-LPS可显著上调hPDLCs RANKL、Notch通路受体Notch4、配体DLL-1、Jagged-1及目的基因Hey-1的表达(P＜0．05)；而对OPG、Nocth1-2、Jagged-2 m RNA水平表达无明显影响(P＞0．05)。此外，γ-分泌酶抑制剂DAPT可抑制Pg-LPS诱导RANKL及Hey-1 mRNA及蛋白的表达上调，而仅对OPG m RNA表达有影响(P＜0．05)。结论：Notch信号通路参与调控Pg-LPS诱导的h PDLCs RANKL/OPG表达。

牙龈卟啉单胞菌;脂多糖；RANKL/OPG; Notch通路

牙周炎是一种慢性感染性疾病，在老年人群具有很高的发病率，严重影响老年人的口腔和全身健康。牙菌斑生物膜是牙周炎的始动因子，其主要病理特征为牙槽骨破坏吸收等[1]。骨代谢相关蛋白核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand ，RANKL)是与骨吸收密切相关的破骨因子，在牙周炎症反应中发挥诱导破骨细胞分化的作用[2],多种原因可导致牙周组织中RANKL水平发生变化[3]。脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)是牙周炎主要致病菌牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，Pg)最重要的致病因子，可促进淋巴细胞炎症因子分泌上调，激活破骨因子表达，导致牙槽骨破坏吸收[4,5]。有文献报道：Pg-LPS可上调牙周膜细胞、成骨细胞RANKL的表达[6]，但是其调控机制尚未明确。近期研究发现，Notch通路参与调控RANKL诱导的破骨细胞生成过程[7],但Notch通路是否在Pg-LPS诱导的牙周炎症破骨免疫中发挥作用仍缺乏报道。因此，本实验拟检测Pg-LPS作用于hPDLCs后Notch通路相关基因和蛋白的表达，并进一步分析该通路对Pg-LPS诱导hPDLCs RANKL/OPG表达的影响，以初步探讨Notch通路在牙周炎症性骨破坏中作用的相关机制。

1．材料和方法

1．1 主要材料、试剂和仪器胎牛血清(Gibco，USA)；胰蛋白酶、青链霉素双抗(Sigma，USA)；α-MEM培养基、I型胶原酶(Gibco，USA)；Pg-LPS (Invivogen，USA); DAPT(Sigm a，USA)；Trizol(Invitrogen，USA)；PCR引物(Life Technologies，USA)；Hey-1单克隆抗体(Abcam，UK)、RANKL单克隆抗体(San ta-Cruz，USA)、OPG单克隆抗体(Abcam，UK)；抗细胞角蛋白单克隆抗体，抗波形丝蛋白单克隆抗体(武汉博士德生物公司)，逆转录试剂盒(Takara，Japan)；多功能酶标仪(Tecan，UK);NanoDrop-2000微量紫外分光光度计(Therm o，USA)；Ligh t Cycler R○ 480 SYBR Green I MasteLigh t Cycler R○ 480 PCR 仪Roche，Sw iss)。

1．2 人牙周膜成纤维细胞原代培养选择中山大学附属口腔外科门诊因正畸治疗拔出的健康双尖牙或智齿，所选牙无龋坏、无根尖周病及牙周炎，患者近三个月内未使用抗生素，无糖尿病史，吸烟史。年龄为12-25岁，且征得患者本人及家属同意。该实验已通过中山大学附属口腔医院伦理委员会审核批鉴：口腔[2015]伦审第(13)号。将外科门诊收取的离体牙用含双抗的PBS反复冲洗，采用刀片刮取根中1/3部位的牙周膜组织于含有3mg/m l的I型胶原酶中，消化30m in，10%含FBS α-MEM培养基终止消化，将悬液接种于含20%FBS，2%青链霉素双抗的α-MEM培养基中，过夜翻转培养瓶，继续培养。待细胞爬满瓶底约70%，弃培养基，0．25%胰蛋白酶消化，传代，取第三代至第五代细胞用于后续实验。

1．3 免疫组织化学染色法鉴定取第三代hPDLCs，以2×104/m l接种于12孔板，取爬片置于12孔板中，培养箱培养24h。细胞融合率达50%弃培养基，4%多聚甲醛室温固定20m in，PBS漂洗三次，0．1%Triton-X100室温通透，3%过氧化氢孵育，5%BSA封闭30m in后，分别滴加1∶100稀释的一抗Vim itin和CK,阴性对照滴加PBS，湿盒4℃过夜。PBS振洗后加入二抗，DBA显色，树胶封片，拍照。

1．4 实验分组

1．4．1 浓度梯度实验分组(1)空白对照组：只加α-MEM培养基；(2)0．1μg/m l Pg-LPS组；(3)1μg/m l Pg-LPS组；(4)10μg/m l Pg-LPS组。

1．4．2 阻断实验分组(1)空白对照组：只加α-MEM培养基；(2)Pg-LPS组：予1μg/m l Pg-LPS刺激hPDLCs；(3)DAPT阻断组：10μM Notch 通路阻断剂DAPT预处理hPDLCs1h，随后加入1μg/m l Pg-LPS刺激hPDLCs。

1．5 细胞处理及培养取第三代至第五代hPDLCs以5×104/m l密度接种于6孔板中，待24h贴壁完全后换液，按照分组给予刺激，于5% CO2，37℃饱和湿度环境下培养细胞72h。

1．6 Real-time PCR检测使用Trizol法提取总RNA，以Nanodrop2000微量紫外分光光度计测定RNA浓度。采用TAKARA逆转录试剂盒合成cDNA。委托广州英潍捷基生物技术有限公司设计、合成引物。引物见表1。根据罗氏Ligh t Cycler480 SYBR Green I M aster试剂盒说明书，采用20μl反应体系: DEPC水6μL、2μL cDNA模板、2μL 3R+5F、10μL SYBR Green I。反应条件如下：激活酶活性：95℃5m in；变性：95℃10s；退火：60℃20s；延伸：72℃20s，循环40次；溶解曲线：95℃5s，65℃1m in，97℃。

表1 合成引物序列

1．7 W estern blot 检测细胞蛋白表达RIPA裂解液提取蛋白，BCA法检测各组蛋白浓度，上样质量40μg, 10%SDS-PAGE胶电泳，转移蛋白至PVDF膜上，5%脱脂牛奶常温封闭1h，根据分子量大小剪膜，摇床孵育一定稀释度一抗4℃过夜，TBST洗膜，孵育二抗室温1h，TBST洗膜后ECL发光检测，使用Image J软件分析条带灰度值。

1．8 统计学分析采用SPSS 21．0软件进行统计学分析，两组间采用独立样本t检验；多组间在方差齐性的基础上使用单因素方差分析, 最小显著差法(least significant difference，LSD)进行组内两两比较，P＜0．05认为差异具有统计学意义，运用Graphpad Prism 6．0软件制图。

2．结果

2．1 人牙周膜成纤维细胞的培养和鉴定倒置显微镜下观察：原代细胞培养约一周左右, 可见细胞由组织块中爬出。传代后细胞生长旺盛，状态良好，细胞呈现典型星形或梭形，胞体丰满，胞浆均匀，细胞核呈圆形或者软圆形，具有成纤维细胞的形态特点。免疫细胞化学染色鉴定显示：细胞抗波形丝蛋白染色阳性，细胞浆呈棕黄色；抗角蛋白染色阴性，细胞浆不着色。证实细胞来源于中胚层的成纤维样细胞。

图1 倒置显微镜下h PDLCs形态及免疫组化染色图像

2．2 不同浓度Pg-LPS对hPDLCs RANKL/ OPGmRNA表达的影响0．1、1、10μg/m l Pg-LPS均可上调hPDLCs RANKLmRNA的表达。1、10μg/m l浓度组RANKLm RNA显著上调，且1μg/m l组RANKLmRNA上调最明显(P＜0．05);而0．1μg/m l组与对照组无显著差异(P＞0．05)。表明Pg-LPS具有上调RANKLmRNA表达的作用，且刺激浓度为1μg/m l时上调作用最明显。对于OPGmRNA的表达水平，0．1、1μg/m l两浓度组与对照组比较无明显差异(P＞0．05)，10μg/m l Pg-LPS可显著下调OPGm RNA水平(P＜0．05)。

图2 0、0．1、1、10μg/m l Pg-LPS刺激hPDLCs对RANKLm RNA及OPGmRNA的表达影响

2．3 Pg-LPS作用hPDLCs后Notch通路相关受体、配体及靶基因的表达Real-time PCR结果显示，Notch通路受体Notch4、配体Dll-1、Jagged-1以及靶基因Hey-1表达相较于对照组均显著上调(P＜0．05)，而Notch1、Notch2、Jagged-2的表达无明显改变(P＞0．05)。

2．4 DAPT阻断剂对Pg-LPS调控RANKL/ OPG的影响

Real-time PCR结果显示，10μM DAPT预处理hPDLCs后，Hey-1 mRNA及RANKL mRNA的表达显著下降(P＜0．05)，而OPGm RNA的表达上调(P＜0．05)。

图3 1μg/m lPg-LPS作用h PDLCs对Notch信号通路相关因子表达的影响

图4 DAPT阻断Notch通路后对Pg-LPS诱导RANKL/OPG及Hey-1的作用影响

Western blot结果显示，Pg-LPS刺激可显著上调RANKL、Hey-1蛋白的表达水平(P＜0．05)，而OPG蛋白表达水平虽稍有降低，但与对照组相比无统计学差异(P＞0．05)。DAPT预处理hPDLCs 1h后，RANKL及Hey-1的蛋白水平表达均显著下调(P＜0．05)；而OPG蛋白表达水平有所上调，但与Pg-LPS组相比无统计学差异(P＞0．05)。

图5 DAPT阻断Notch通路对Pg-LPS调控RANKL/OPG蛋白表达及Hey-1的影响

3．讨论

牙龈卟啉单胞菌是牙周炎主要致病菌，脂多糖是其最主要的毒力因子，可刺激RANKL表达上调，参与牙槽骨破坏[6]。RANKL是肿瘤坏死因子超家族的成员，可与受体RANK结合，促进破骨前体细胞分化成熟，激活骨吸收。而溶性诱骗受体骨保护素(osteoprotegerin，OPG )可竞争性结合RANKL以阻断RANKL-RANK通路，抑制RANKL所介导的破骨作用，起到骨保护作用[2]。现已明确：在牙周组织中RANKL主要表达在成骨细胞、淋巴细胞中，而在牙周膜成纤维细胞、牙龈成纤维细胞中也有表达。牙周膜成纤维细胞是牙周膜的主要成分，在牙周炎症环境下具有破骨向分化的能力，对于维持牙周组织骨平衡、调控牙周炎发生发展的过程中有重要作用。因此，本实验选择hPDLCs作为研究对象，在体外使用Pg-LPS加以刺激，结果发现0．1、1μg/m l Pg-LPS可上调RANKL的表达，且呈浓度依赖形式，但对OPG表达的刺激作用不明显。上述结果一方面进一步证实了hPDLCs是牙周炎症环境中RANKL的重要来源细胞之一，另一方面也表明Pg-LPS可改变hPDLCs表达RANKL/OPG的比率，干扰RANKL/OPG的平衡，从而在牙周炎症性破骨免疫中发挥一定的作用。此外，本实验中10μg/m l Pg-LPS作用于hPDLCs后RANKL和OPG mRNA表达较1μg/m l明显下调，这与李新月等[8]研究结果存在差异。分析其原因一方面可能与实验使用培养基不同，以及h PDLCs来源不同存在遗传异质性有关；另一方面可能是由于高浓度Pg-LPS对hPDLCs有一定的毒性作用，对细胞增殖存在抑制。因此，高浓度Pg-LPS对hPDLCs RANKL/OPG表达的具体作用机制尚需进一步研究。结合本实验结果及文献相关报道，本实验使用1μg/m l Pg-LPS作为后续实验诱导浓度。

Notch信号是由一系列蛋白分子组成，在哺乳动物中已发现四种同源性受体(Notch1-4)和五种配体Jagged-1、Jagged-2、Delta-like1、Delta-like3、Delta-like4。该通路通过γ-分泌酶(γ-secretase)切割释放Notch的胞内活性片段N ICD(The in tracellu lar dom ain of Notch)直接入胞核，结合并激活转录因子RBP-J促进靶基因Hes-1和Hey-1的表达，激活下游相关基因转录。在与牙周炎具有相似病理病因的类风湿性关节炎患者滑膜细胞中发现Notch1、Jagged-1以及DLL-1明显上调[9]。体外实验中，Tsao等[10]发现经LPS诱导的巨噬细胞依赖JNK信号通路高表达Notch1、DLL-4、Jagged-1。此外，研究表明Pg-LPS可促进前成骨细胞Notch1、Hey-1的表达上调参与阻断细胞成骨过程[11]。为进一步探索牙周致病菌作用下Notch通路是否被激活，本实验使用1μg/m l Pg-LPS刺激hPDLCs，发现Notch通路目的基因Hey-1在蛋白水平及基因水平表达均上调，提示Pg-LPS刺激hPDLCs后Notch信号被激活。现已知Notch通路在促进破骨生成作用过程中依赖于配体受体间的相互作用。本实验结果显示，与类风湿性关节炎患者滑膜细胞、大鼠巨噬细胞主要上调Notch1、Notch2不同，经Pg-LPS刺激诱导的hPDLCs上调Notch4最显著，而Notch1、Notch2上调作用不明显。同时，Notch通路配体DLL-1、Jagged-1也表达上调，而Jagged-2表达无明显改变。Sekine等[12]报道：在破骨前体细胞中DLL1/Notch2具有促进破骨生成作用，而Jagged-1/Notch1可抑制破骨前体细胞破骨向生成，且DLL1/Notch2的正向破骨调控作用占主导地位。以上研究表明炎症环境下不同细胞Notch通路受体及配体表达具有差异，而细胞表达不同受体配体在破骨分化过程也发挥不同作用。本实验结果提示Pg-LPS可激活hPDLCs Notch通路, Notch通路参与牙周免疫炎症反应。而在牙周炎症环境下不同受体及配体间的相互作用是否发挥不同甚至相反的作用，尚需更进一步的研究。

近年来Notch通路在骨免疫炎症相关研究中备受瞩目。K ikuta等[13]通过大鼠体内实验报道Notch通路阻断剂DAPT可阻断牙周膜细胞通过RANKL及IL-6介导的牙根吸收。Manokaw inchoke等[14]使用Fc Jagged-1显著下调hPDLCs OPG/RANKL的比例，经Fc Jagged-1处理后的hPDLCs明显促进破骨生成，表明Notch通路可上调RANKL/ OPG表达参与破骨生成。但与之相反的是，Osathanon等[15]报道Jagged-1可促进人牙周膜干细胞(Hum an periodontal ligam en t stem cell，hPDLSCs)的成骨作用, 提示Notch通路可能具有促进细胞成骨向分化作用。上述研究结果表明Notch通路在参与炎症性骨免疫中可能发挥成骨破骨双向作用。为明确Notch通路在牙周致病菌作用下是否参与RANKL介导的破骨作用，本实验使用Notch通路阻断剂DAPT预处理Pg-LPS诱导的hPDLCs，发现Notch通路Hey-1mRNA及蛋白水平均表达下调，表明DAPT可有效抑制h PDLCs Notch通路。此外，经Pg-LPS诱导上调的RANKL在mRNA水平及蛋白水平均下调，这提示Pg-LPS诱导的RANKL上调依赖于Notch信号通路，证实Notch通路在牙周致病菌作用下具有促进破骨生成作用。然而，本研究仅局限于体外Notch通路对牙周膜细胞的破骨免疫研究，尚需更多研究明确Notch通路在牙周炎发生发展中是否发挥作用。此外，经DAPT处理后hPDLCs OPG m RNA水平虽然显著上升，但是蛋白水平未发生明显改变。OPG m RNA和蛋白表达不一致其原因可能是OPG在转录水平和翻译水平过程中存在时间间隔或由于OPG表达受其他通路及炎性因子共同介导。

综上，本实验结果表明：Pg-LPS可上调hPDLCs RANKL/OPG的表达。在此过程中，Notch通路被激活，参与Pg-LPS调控的RANKL/ OPG上调，提示Notch在牙周炎症破骨免疫中发挥一定作用。然而在复杂的牙周炎症环境下，多种免疫细胞及大量炎症因子共存，Notch通路在牙周炎症下发挥骨免疫作用的确切机制还需要进一步研究。

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Role of Notch pathway in RANKL/OPG expression induced by Porphyromonas gingivalis L ipopolysaccharidein human periodontal ligament cells

ZHANG Chi,CHENQian-ying,ZHAO Ya-jing,GAO Li,ZHAOChuan-jiang(Departmentof Periodontology,Guanghua School of Stomatology,Hospital of Stomatology,Sun Yat-sen University&Guangdong Provincial Key Laboratory of Stomatology,Guangzhou 510055,China)

Objective:To detect the expression of Notch signaling factors in human periodontal ligament cells(hPDLCs) treated w ith Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide (Pg-LPS), and further exp lore their roles involving in the expression of RANKL/OPG. M ethods:Primary hPDLCs were cultured using combined methods of tissue explant and enzymatic digestion. Passage third-fifth cells were treated w ith 0.1、1、10μg /m l Pg-LPS, and the expression of RANKL/OPG in hPDLCs was detected by Real-time PCR after 72h. Meanwhile, the expressions of DLL-1, Hey-1, Notch4, Jagged1-2, Notch1-2 were assessed in hPDLCs treated with 1μg/m l LPS. Furthermore, hPDLCs were pretreated with the γ-secretase inhibitor, namely DAPT, for 1 hour, and then co-cultured w ith 1μg/m l Pg-LPS for 72 hours, the expression of RANKL/OPG and Hey-1 were measured using western-blotting and real-time PCR. Resu lts:The mRNA expression of RANKL, as well as DLL-1、Jagged-1、Notch4 and Hey-1 were significantly elevated in hPDLCs stimulated w ith 1μg /m l Pg-LPS (P＜0.05).After blocking the notch signaling pathway with DAPT, both mRNA and protein levels of RANKL and Hey-1expression were down-regulated as comparing w ith control hPDLCs treated w ith Pg-LPS (P＜0.05). Conclusion:Notch signaling pathw ay is involved in the Pg-LPS induced RANKL/OPG expression in human periodontal ligament cells.

Porphyromonas gingivalis; Lipopolysaccharide; RANKL/OPG; Notch signaling pathway

R781

A

1672-2973(2017)02-0097-06

2016-10-23)

张驰 中山大学光华口腔医学院附属口腔医院·广东省口腔医学重点实验室硕士生广东510055

陈倩莹 中山大学光华口腔医学院附属口腔医院·广东省口腔医学重点实验室硕士生广东510055

赵雅静 中山大学光华口腔医学院附属口腔医院·广东省口腔医学重点实验室硕士生广东510055

高雳 中山大学光华口腔医学院附属口腔医院牙周科博士广东510055

赵川江 通讯作者中山大学光华口腔医学院附属口腔医院牙周科副教授广东510055