付昌盛 刘荣森 罗芸 欧龙 李颖超 张贤华 王珺 杜岩

内毒素对人牙周膜成纤维细胞增殖及IL-8分泌的影响

付昌盛 刘荣森 罗芸 欧龙 李颖超 张贤华 王珺 杜岩

目的：观察不同浓度的内毒素(lipopolysaccharides，LPS)对牙周膜成纤维细胞增殖的影响及IL-8的分泌情况。方法：本实验共分为七组，牙周膜成纤维细胞(hum an periodon tal ligam ent fibroblasts，hPDLFs)组、PDLFs+10μg/m l碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Grow th Factor，BFGF)组、1μg/m l LPS组、10μg/m l LPS组、100μg/m l LPS组、200μg/m l LPS组、500μg/m l LPS组。各组细胞进行培养，MTT法观察细胞增殖变化。取培养24h，96h的细胞上清液进行IL-8 ELISA 检测。结果：与空白组牙周膜成纤维细胞相比，24h：1μg/m l LPS、10μg/m l LPS、100μg/m l LPS组无统计学差异。200μg/m l LPS、500μg/m l LPS组促进IL-8分泌，有显著性统计学差异。96h：与牙周膜成纤维细胞相比，1μg/m l LPS、10μg/m l LPS组无统计学差异。100μg/m l LPS、200μg/m l LPS组促进IL-8分泌，100μg/m l LPS、200μg/m l LPS组之间无统计学差异。500μg/m l LPS组抑制IL-8分泌，有显著性统计学差异。细胞增殖变化：BFGF促进牙周膜成纤维细胞增殖。1μg/m l LPS、100μg/m l LPS组与正常牙周膜成纤维生长增殖无差异。10μg/m l LPS可以促进牙周膜成纤维细胞增殖。200μg/m l LPS、500μg/m l LPS明显抑制PDLFs增殖。结论：不同浓度的内毒素对牙周膜成纤维细胞增殖、IL-8分泌合成释放有调节作用。

内毒素；牙周膜成纤维细胞；IL-8

牙周膜成纤维细胞(hum an periodon tal ligam ent fibrob lasts，hPDLFs)，作为牙周膜中最主要的细胞成分之一，在牙周病发生发展过程中起着十分重要的作用[1]。在牙周炎各阶段，它既有修复作用，又可以影响生成分泌各类炎症因子[1]，是研究牙周炎发病机制的重要细胞之一。白介素-8(IL-8)在牙周炎的免疫反应中起到中枢作用，作为一种能趋化中性多形核白细胞、T淋巴细胞和单核细胞等免疫细胞的细胞因子，它能够介导局部炎症反应[2]，对于研究内毒素耐受对牙周组织的炎症和免疫反应的影响具有非常重要的意义。

内毒素即脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)对牙周膜成纤维细胞剂效关系及IL-8分泌的研究较少。本实验旨在观察牙周膜成纤维细胞在不同浓度内毒素刺激下其细胞增殖以及IL-8分泌合成释放的研究。对内毒素刺激下PDLFs模型的建立进行探索，为治疗控制牙周炎发生发展提供资料。

1．材料和方法

1．1 材料DMEM培养基(GE，美国)；10%胎牛血清(FBS)、0．25%胰蛋白酶(thermo,美国)；100U/m l青霉素、100U/m l链霉素(灏洋，中国)；PBS溶液(北京中杉金桥生物技术有限公司)；5% MTT溶液(R&D公司，美国)；内毒素标准品、碱性成纤维细胞生长因子、Tris溶液、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma,美国)；I型胶原酶、角蛋白单抗、波形丝蛋白单抗体、SABC免疫组化试剂盒、IL-8 ELISA 试剂盒(博士德生物工程有限公司，中国)；针头滤器0．22μm(m illipore，美国)；去离子水。

1．2 牙周膜成纤维细胞培养

1．2．1 纳入排除标准选择解放军总医院口腔颌面外科因正畸要求拔除的12-16岁的健康的无龋病、牙髓病、根尖周病、牙周疾病，未进行过治疗的前磨牙。所有患者无全身系统性疾病，无吸烟史，半年内未服用过抗生素。所得牙齿均征得患者及家长同意，并签署知情同意书。该实验已得到解放军总医院伦理委员会批准。(伦理委员会审批批号：伦理第S2015-097-02号)

1．2．2 人牙周膜成纤维细胞培养及鉴定无菌条件下刮除根中1/3牙周膜进行培养，加入0．2%I型胶原酶进行震荡消化，10%胎牛血清高糖培养基培养后，CO2恒温箱孵育。每3天换液，直至细胞爬出，培养2-3周，待细胞生长达80%进行传代。培养3-6代牙周膜成纤维细胞用于实验。牙周膜成纤维细胞鉴定同本实验室组[3]。

1．3 溶液配制LPS溶液：按说明用PBS配置成1μg/m l LPS、10μg/m l LPS、100μg/m l LPS、200μg/m l LPS、500μg/m l LPS，针头滤器过滤，备用。

碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)：按说明用Tris溶液溶解成10μg/m l的BFGF溶液备用。

1．4 分组本实验共分为7组，每组6个样本。第一组PDLFs、第二组PDLFs+10μg/m l BFGF、第三组1μg/m l LPS、第四组10μg/m l LPS、第五组100μg/m l LPS、第六组200μg/m l LPS、第七组500μg/m l LPS、观察各组牙周膜成纤维细胞在不同浓度的LPS微环境下细胞生长增殖以及IL-8分泌合成释放情况。

1．5 MTT检测牙周膜成纤维细胞生长增殖将第5代牙周膜成纤维细胞4×103/m l每孔接种于96孔板，PDLFs接种培养24h，镜下观察牙周膜成纤维细胞贴壁、生长状态良好，于24h、48h、72h、96h时间点检测其牙周膜成纤维细胞生长增殖。方法：吸净培养液，PBS溶液漂洗2遍，每孔加MTT溶液20μl。37度培养箱内孵育4h，吸净MTT液。每孔依次加150μl二甲基亚砜，振荡10m in，使结晶物能够充分融解。酶联免疫监测仪于490nm波长下测定各孔吸光度(OD值)，记录结果，以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1．6 IL-8 的检测将第5代牙周膜成纤维细胞4×103/m l每孔接种于96孔板，PDLFs接种培养24h，镜下观察牙周膜成纤维细胞贴壁、生长状态良好，取24h、96h细胞培养上清液，离心后-80度保存，采用ELISA法检测IL-8因子的分泌合成释放情况。ELISA法检测步骤如下：配置标准品，加入样品标准品至96孔板，空白组为样品稀释液。酶标板封膜后37度反应90m in。甩去酶标板内液体，每孔加抗体工作液，空白孔除外。酶标板封膜后37度反应60m in。一倍洗涤液洗3次，每次浸泡1m in。加入亲和素-过氧化物酶复合物工作液(空白孔除外)。酶标板封膜反应30m in。一倍洗涤液洗5次，每次浸泡1-2m in。每孔加入90ul显色液，37度避光20-25m in。每孔加入100μl终止液，酶标仪在450nm测定吸光度值。

1．7 统计学方法本实验数据采用SPSS18．0进行统计分析，细胞生长增殖采取重复测量方差分析，IL-8因子的分泌合成释放采用组间单因素方差分析后与对照组比较。

2．结果

2．1 细胞增殖情况(见表1，图1-4) BFGF刺激的牙周膜成纤维细胞生长呈线性上升，证明PDLFs与BFGF有着良好的应答关系。与PDLFs组相比，1μg/m l LPS组、100μg/m l LPS组无统计学意义(P＞0．05)；10μg/m l LPS组促进牙周膜成纤维细胞生长，有显著性统计学差异(P＜0．01)；200μg/m l LPS组、500μg/m l LPS组抑制牙周膜成纤维细胞生长,有显著性统计学差异(P＜0．01)。统计学差异(P＞0．05)。200μg/m l LPS、500μg/m l LPS组促进IL-8分泌，有显著性统计学差异(P＜0．01)。

图1 96h,500μg/m l LPS组(×200)

图2 96h,正常PDLFs组(×200)

图3 96h,BFGF组(×200)

图4 MTT法检测各组不同时间点细胞增殖能力

表2 不同浓度LPS刺激细胞后各组IL-8分泌测量OD值(n=6)

表1 MTT法检测各组不同时间点细胞增殖能力(n=6)

2．2 与牙周膜成纤维细胞相比，IL—8分泌合成释放情况(见表2，表3，图5，图6)

2．2．1 (24h)与正常牙周膜成纤维细胞组相比1μg/m l LPS、10μg/m l LPS、100μg/m l LPS组无

2．2．2 (96h) 与正常牙周膜成纤维细胞组相比1μg/m l LPS、10μg/m l LPS组无统计学差异(P＞0．05)。100μg/m l LPS、200μg/m l LPS组促进IL-8分泌，100μg/m l LPS、200μg/m l LPS组之间无统计学差异(P＞0．05)。500μg/m l LPS组抑制IL-8分泌，有显著性统计学差异(P＜0．01)。

表3 不同浓度LPS刺激细胞后各组IL-8分泌测量(pg/m l)(n=6)

图5 ELISA IL-8标准曲线

图6 LPS刺激细胞后各组IL-8分泌量*表示与PDLFs组相比，差异有统计学意义(P＜0．01)

3．讨论

内毒素是牙周病原菌的重要的毒力因子之一，也是一种潜在的细胞激活因子，对牙周组织有较高的毒性及抗原性，是牙周炎的主要病因之一，它可以直接作用于牙周组织细胞[4,5], 而长期的LPS刺激可能使机体对后续刺激的反应性降低，即产生内毒素耐受[6]。牙周组织处于炎症状态下，内毒素耐受可能因机体不能及时有效清除入侵细菌，导致炎症迁延[7]。牙周膜成纤维细胞在牙周组织健康中承担着重要的角色[1],内毒素会直接影响牙周膜成纤维细胞的生长与增殖, 并对细胞超微结构有不同程度的损伤[8]。PDLFs 作为牙周膜主要细胞之一具有多种细胞生物学活性[8], 其损伤会给牙周组织的健康带来严重的危害,阻碍牙周组织的再生与修复。在牙周炎的发生发展过程中，内毒素参与牙槽骨、牙龈、牙周韧带的炎症破坏和丧失[9]。避免持续LPS刺激导致的过度反应对机体造成的损伤，是宿主防御机制的重要组成部分[10]，维持在一定范围内的内毒素含量，维护牙周组织的健康，避免免疫系统的过度活化产生大量的炎症因子，引发严重的免疫破坏，引起组织损伤，对于牙周炎的治疗和预后具有重要的意义[11]，值得进一步研究。

在牙周炎发生发展期间，IL-8承担重要作用，作为免疫调节因子促使破骨细胞分化、成熟、维持骨吸收活性，而作为促炎因子参与牙周组织破坏。内毒素和其他因子刺激下，中性粒细胞以及骨代谢体系中的成骨细胞和破骨细胞都有IL-8的生成[12]。因此，IL-8是参与牙周炎发生发展过程和牙槽骨吸收病理代谢过程之中因子之一。但其表达受到多种牙周致病刺激因素的影响[13]。

本实验旨在研究不同浓度LPS对hPDLFs生长增殖以及分泌IL-8的影响。牙周膜成纤维细胞会随时间的生长达到对数平台期，本实验在96h时细胞达到最高峰。在IL-8检测时选取24h细胞贴壁后细胞生长初级阶段，96h细胞生长最高峰阶段，对比两阶段的各组细胞分泌IL-8的情况。本实验表明短时间的低剂量的LPS与正常的牙周膜成纤维细胞分泌IL-8并无差异，而短时间高剂量的LPS会促进IL-8的生成。从而促进炎症的加速进展，破坏牙周组织。而96小时100μg/m l LPS, 200μg/m l LPS会促进IL-8的分泌。1μg/m l LPS、10μg/m l LPS与正常牙周膜成纤维细胞相比无差别。牙周膜作为免疫应答细胞可以修复一定范围的炎症，从而达到牙周组织微环境的平衡。长时间的高浓度的LPS刺激下已经超过了PDLFs的调节范围。从而加速牙周炎的发生发展。使其促进IL-8的分泌从而加速破坏牙周组织，阻碍牙周膜成纤维细胞的自我修复。过高浓度的LPS显著抑制牙周膜成纤维细胞的生长与增殖。96h时500μg/m l LPS组IL-8分泌合成释放量明显下降。可能原因是，高剂量的LPS明显抑制PDLFs生长增殖，甚至促进PDLFs的凋亡。BFGF明显促进PDLFs生长增殖，导致IL-8合成释放也明显增加，在24h,两组细胞生长无显著差异，IL-8亦无统计学差异。96h时两者细胞生长增殖有显著差异，IL-8分泌合成释放也有统计学意义。BFGF组细胞增殖明显高于对照组、IL-8分泌合成亦高于对照组。故而说明IL-8分泌合成释放与PDLFs数量有关。500μg/m l LPS显著抑制PDLFs生长增殖。后期在细胞凋亡时IL-8分泌合成释放会随之减少。100μg/m l LPS无明显促进或抑制牙周膜成纤维细胞的生长和增殖，且会促进牙周膜成纤维细胞分泌IL-8分泌，为较理想的LPS耐受模型的浓度，为后期实验作为铺垫。

综上所述，本实验结果表明10μg/m l LPS可以促进牙周膜成纤维细胞生长，1μg/m l LPS、100μg/m l LPS与正常牙周膜成纤维细胞增殖无差别。200μg/m l LPS、500μg/m l LPS抑制牙周膜成纤维细胞生长。96h，IL-8分泌合成释放实验观察：100μg/m l LPS刺激合成分泌释放IL-8量远远大于正常PDLFs组。不同浓度的LPS对PDLFs增殖、IL-8分泌具有调节作用。100μg/m l LPS更适合建立内毒素耐受模型，为内毒素作用下对牙周膜成纤维细胞的影响提供资料。

[1] Jönsson D, Nebel D, B ratthall G, et al． The hum an periodon tal ligam ent cell: a fib rob last-like cell acting as an immune cell[J]． J Periodontal Res, 2011, 46(2): 153-157

[2] 孙梦君, 李慧, 孙颖, 等． 内毒素耐受对人牙龈上皮细胞分泌IL-1β、IL-6和IL-8的影响[J]． 口腔医学研究，2012，28(3): 223-226

[3] 王珺, 欧龙, 罗芸, 等． 茶多酚对脂多糖诱导人牙周膜成纤维细胞凋亡及炎症因子的影响[J]． 中华老年口腔医学杂志，2015, 13(2): 80-84

[4] Tsutsum i T, Takesh i T, Nakash ima K, et al． Involvem ent of adhesion molecule in in vitro plaque-like formation of macrophages stimulated w ith Aggregatibacter actinom ycetemcom itans lipopolysaccharide[J]． J Periodontal Res, 2010, 45(4): 550-556

[5] Johnson GK, Guthm iller JM, Joly S, et al． Interleukin-1 and interleuk in-8 in nicotine- and lipopolysaccharide-exposed ging ival keratinocy te cu ltures[J]． J Periodontal Res, 2010, 45 (4): 583-588

[6] Sun Y, Li H, Yang MF, et al． Effects of aging on endotoxin tolerance induced by lipopolysaccharides derived from Porphy romonas gingivalis and Escherichia coli[J]． PLoS One, 2012, 7(6): e39224

[7] 许雯静, 李艳芬, 闫福华, 等． IL-10对Pg-LPS刺激下兔枯否氏细胞凋亡的影响[J]． 口腔医学研究，2012，28(7): 636-639

[8] El-Aw ady AR, Lapp CA, Gam al AY, et al． Human periodontal ligam ent fibroblast responses to compression in ch ron ic periodon titis[J]． J Clin Periodon tol, 2013, 40(7): 661-671

[9] Li X, Kato N, Mezawa M, et al． Transcriptional regulation of bone sialoprotein gene by Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide[J]． J Cell Biochem, 2010, 110(4): 823-833

[10] Gerhold K, Avagyan A, Reichert E, et al． Lipopolysaccharides modulate allergen-specific immune regulation in a m u rine m odel of mucosal tolerance induction． In t A rch A llergy Imm unol, 2008, 147(1): 25-34

[11] 李慧, 孙梦君, 徐艳, 等． IFN-γ对牙龈卟啉单胞菌内毒素诱导的细胞耐受的影响[J]． 口腔医学研究，2014, 30(2): 100-103

[12] 郑健, 李海如． 牙周炎患者龈沟液中白细胞介素-8水平的变化[J]． 标记免疫分析与临床，2011, 18(6): 392-394

[13] 李新月． 脂多糖对牙周膜成纤维细胞IL-8和RANKL基因表达的调节作用[J]． 天津医科大学学报，2013, 19(6): 452-455

Effectsof lipopolysaccharideson the proliferation and IL-8 secretion of periodontal ligam ent fibroblasts

FUChang-sheng,LIURong-sen,LUO Yun,OU Long,LIYing-chao,ZHANGXian-hua,WANG Jun,DUYan(Departmentof Somatology,Chinese PLAGeneralHospital,Beijing 100853,China)

Objective:To observe the effects of different concentrations of lipopolysaccharides on the proliferation of periodontal ligament fibroblasts and the secretion of IL-8. M ethods:The experiments were divided into seven groups, human periodontal ligament fibroblasts (hPDLFs) group, PDLFs + 10μg/m l basic fibroblast grow th factor (BFGF) group, 1μg/m l LPS group, 10μg/m l LPS group, 100μg/m l LPS group, 200μg/m l LPS group, 500μg/m l LPS group. The cells w ere cultured and MTT assay was used to observe the cell proliferation. The cell supernatant after cultured for 24h and 96h was collected of IL-8 ELISA. Results:Synthesis and release of IL-8: Com pared w ith periodontal ligament fibroblasts group, there were no statistically significant differences in 1μg/m l LPS, 10μg/m l LPS and 100μg/m l LPS groups after cultured for 24h; significant statistical differences were detected in 200μg/m l LPS, 500μg/m l LPS groups. Compared w ith periodontal ligament fibroblasts group, there were no statistically significant differences in 1μg/m l LPS and 10μg/m l LPS group after cultured for 96h; significant statistical differences were detected in 100μg/m l LPS, 200μg/m l LPS, 500μg/m l LPS groups, there was no significant difference between 100μg/m l LPS and 200μg/m l LPS group. Proliferation of human periodontal ligament fibroblasts: there were no statistically significant differences between 1μg/m l LPS, 100μg/m l LPS and controlgroups. The promotion of the proliferation of periodontal ligament fibroblasts was observed in 10μg/m l LPS group. 200μg/m l LPS, 500μg/m l LPS significantly inhibited the proliferation of PDLFs. Conclusion:Different concentrations of lipopolysaccharides can regulate the proliferation of periodontal ligament fibroblasts and the synthesis and release of IL-8. Keywords:lipopolysaccharides; periodontal ligament fibroblasts; IL-8

R781．4

A

1672-2973(2017)02-0082-05

2016-10-09)

付昌盛 解放军总医院口腔科硕士生北京100853

刘荣森 通讯作者解放军总医院口腔科主任医师教授北京100853

罗芸 解放军总医院老年病医学研究所细胞生物研究室副研究员北京100853

欧龙 解放军总医院口腔科副主任医师北京100853

李颖超 解放军总医院口腔科副主任医师北京100853

张贤华 解放军总医院口腔科副主任医师北京100853

王珺 海军机关门诊部口腔科副主任医师北京100841

杜岩 解放军总医院口腔科主治医师北京100853