贺小贤， 魏洁茹， 宇文亚焕，2， 郑茂奎 ， 胡 瑾

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.陕西国际商贸学院 医药学院， 陕西 咸阳 712046)



微囊细胞Nisin发酵条件的研究

贺小贤1， 魏洁茹1， 宇文亚焕1，2， 郑茂奎1， 胡 瑾1

(1.陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021； 2.陕西国际商贸学院 医药学院， 陕西 咸阳 712046)

为了提高乳链菌肽(Nisin)的生产效率，采用嗜热乳链球菌6032 ACA微囊细胞发酵生产乳链菌肽(Nisin).比较微囊化细胞与游离细胞的发酵效果，并通过电镜对不同时期的微囊壁结构进行观察，确定微囊的稳定性.在单次单因素实验的基础上，根据Box-Behnken中心组和设计原理，采用响应面法优化发酵条件.实验结果表明微囊细胞发酵的效价高于游离细胞，在一定时间内，微囊细胞发酵稳定性好，随着时间的延长，微囊破裂，效价降低.实验确定的最适条件为：pH 6.1，培养温度28.7 ℃，发酵时间20 h，在此条件下得到Nisin的效价为5 460.00 IU/mL.经实验验证实验值与理论预测值拟合良好，证明通过响应面分析法对嗜热乳链球菌6032 ACA液芯微囊发酵生产Nisin发酵条件的优化是有效的.

嗜热乳链球菌； ACA液芯微囊； Nisin； 发酵条件； 响应面分析

0 引言

乳链菌肽，又被称为乳酸链球菌素或乳链球菌肽，英文名为Nisin，是乳酸球菌属微生物代谢过程中合成和分泌的一类具有抑菌作用的小分子肽，也是美国食品和药物管理局(FDA)以及世界卫生组织(WTO)允许商业化生产的食品添加剂[1].它能够有效抑制大部分革兰氏阳性细菌以及芽孢杆菌的繁殖，特别是对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌的抑制作用明显[2-4].

但游离的乳酸菌在发酵的过程中存在无法重复利用和Nisin产率低等问题，为了解决这一问题，有学者提出利用细胞微胶囊技术[5,6]来发酵生产Nisin.Kordikanlioglu B[7]和Simsek O[8]通过构建表面含几丁结构的乳酸菌微囊，实现了连续发酵生产Nisin.有研究表明制备ACA微囊有利于菌体的生长和代谢.而在Nisin发酵的过程中其Nisin效价不仅受到液芯微囊的影响，也受到发酵pH[9]、盐离子浓度、接种量、培养温度[10]及发酵时间等的影响.本实验采用嗜热链球菌6032 ACA液芯微囊发酵生产乳链菌肽，优化生产条件，提高乳链菌肽的效价和产率，为工业化应用打下良好的基础.

1 实验部分

1.1 材料与仪器

(1)主要材料：嗜热乳链球菌6032，金黄色葡萄球菌均是保藏于本实验室.壳聚糖(DD≧80%～95%，80目，Japan)；海藻酸钠，无水氯化钙，柠檬酸钠，氯化钠，磷酸氢二钠，硫酸镁，蔗糖，葡萄糖，磷酸二氢钾均为(天津市天力化学试剂有限公司)；蛋白胨，琼脂粉，酵母浸粉均为(北京奥博星生物技术有限公司)；柠檬酸氢二胺(天津登丰化学试剂有限公司)，硫酸锰(洛阳市化学试剂厂)，以上试剂均为分析纯.玉米浆(陕西宝鸡阜丰有限公司)工业级，吐温-80(中国成都金山化学试剂厂)化学纯，冰乙酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)色谱纯.

(2)主要仪器：Nisin标准品，美国Sigma公司.场发射扫描电镜，S4800，日本理学.

1.2 培养基

1.2.1 种子培养基

种子培养基成分：蔗糖1 g，酵母膏1 g，蛋白胨1 g，磷酸二氢钾0.2 g，氯化钠0.2 g，硫酸镁0.02 g，吐温-80 0.05 mL，蒸馏水100 mL，pH=7.2.将其在121 ℃下灭菌30 min.

1.2.2 发酵培养基

发酵培养基的成分：蔗糖1 g，酵母膏1 g，蛋白胨1 g，磷酸二氢钾0.2 g，硫酸锰0.058 g，硫酸镁0.025 g，柠檬酸氢二铵0.2 g，玉米浆20%，蒸馏水100 mL.将其在121 ℃下灭菌30 min.

1.2.3 效价检测培养基

效价检测培养基(g/L)：蛋白胨8.0 g，葡萄糖5.0 g，酵母浸粉2.5 g，磷酸氢二钠2.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂粉10.0 g，蒸馏水1 000 mL ，pH7.2～7.4.将所配制的培养基于121 ℃进行灭菌30 min.

1.3 实验方法

1.3.1 种子液的培养

将活化3次后的菌种接入到经过高压灭菌的种子液中，在35 ℃下培养18 h，菌体浓度计数为6.7×109CFU/mL.

1.3.2 游离菌体进行发酵

采用分批发酵法：将种子液接入发酵培养基中，在一定的温度和pH条件下静止培养一段时间.

1.3.3 嗜热乳链球菌6032ACA液芯微囊制备及发酵培养

用挤压法制得ACA嗜热乳链球菌6032液芯微囊[11].将准备好的微囊以5%的接种量接入发酵培养基中，并在一定pH下以一定的温度培养一段时间.

1.3.4 响应面实验设计

在单次单因素实验的基础上，使用Design-Expert软件的Box-Behnken模型响应面设计，以发酵液中的初始pH，培养温度，发酵时间为自变量，以Nisin的效价为响应值，拟合自变量和响应值之间的关系.实验设计如表1所示.

表1 实验设计及因素水平

1.3.5 测定方法

Nisin效价的测定：运用琼脂扩散法[12]测定Nisin的效价.

2 结果与讨论

2.1 微囊发酵方法以及对比实验

通过对微囊细胞发酵及游离细胞发酵生产Nisin进行对比，得出其各自发酵生产Nisin的特性.其实验结果如图1所示.

图1 微囊化细胞与游离细胞发酵Nisin的比较

从图1可以看出，游离细胞发酵进行10 h时开始有大量Nisin的产生，在发酵15 h时Nisin达到最高水平，随着发酵时间的增加，Nisin的效价开始下降.微囊化细胞在10 h时也有Nisin积累，但是低于游离细胞发酵，随着发酵的进行，微囊化细胞发酵在20 h时达到最高水平且高于游离细胞水平.可以看出单批次发酵时微囊化发酵方式的周期要大于游离细胞，这可能是因为游离细胞在发酵液中可以直接利用营养物质代谢生产Nisin，而微囊化发酵方式中底物和产物的传质需要消耗一定的时间.利用微囊化细胞生产Nisin，能够提高Nisin的效价，因为微囊化细胞发酵时，微胶囊提供一个相对稳定的环境，减少了外界环境的影响，菌体的活性稳定，同时囊内的代谢产物达到一定浓度后可以扩散到囊外，解除了产物的反馈抑制作用，使得菌体能够连续的产生Nisin，有利于Nisin效价的提高.

2.2 微胶囊颗粒发酵批次的测定

使用微囊化细胞发酵生产Nisin，每隔20 h更换新鲜培养基，反复发酵，分别测定Nisin的效价，考察微胶囊颗粒的使用批次，其实验结果如图2所示.

图2 不同发酵批次Nisin的效价

由图2可知发酵初始时Nisin的效价比较低，因为在发酵初期由于微胶囊颗粒致密，营养物质的传递和Nisin的传质需要消耗一定的时间，发酵初始阶段Nisin的效价较低，随着发酵批次的增加微囊化细胞能够连续稳定代谢产生Nisin.当发酵进入第12批次时，Nisin的效价开始下降.因为随着发酵的进行，代谢副产物的影响，微囊化颗粒变得膨胀，部分微胶囊发生破裂.当发酵进入17批次时，微胶囊颗粒损坏严重，Nisin的效价水平较低.

为了观察微胶囊在发酵过程中的破损情况，从而确定微囊的稳定性，对不同发酵批次的微胶囊壁进行电镜扫描，如图3所示.

(a)微胶囊颗粒壁 (b)发酵12批次微胶囊壁

(c)发酵17批次微胶囊壁图3 不同发酵时间ACA微胶囊壁的结构扫描电镜(×500)

图3(a)表示制备好的微胶囊壁是由许多结构缠绕在一起形成的致密状结构，其机械性能较好.当微表面胶囊使用12批次后，Nisin的效价开始下降，对微胶囊壁进行电镜扫描，如图3(b)所示.从图3(b)可以看出,囊内部结构交联性下降，囊壁有所破损；随着发酵批次的增加，微胶囊壁结构的连接性变得更差，当发酵进行到17批次时，Nisin效价水平最低.对微胶壁进行结构电镜观察，结果如图3(c)所示.由图3(c)可知，微胶囊壁的结构已经破碎，微胶囊已经不适用于发酵生产，因此，制备的微胶囊可以发酵生产Nisin 12批次.

2.3 ACA微囊发酵生产Nisin影响因素研究

在单因素实验的基础上进行响应面分析，通过Box-Behnken模型.文献[13-16]分析发酵初始pH、培养温度、发酵时间对Nisin效价的影响.

响应值R(Nisin的效价)的实验结果和方差分析如表2和表3所示.用软件Design-expert对实验结果进行二次回归分析，得到二次多项式回归模拟方程R(Nisin的效价)=5 447.67+22.00A+59.50B+6.5C+201.00AB+21.001AC+135.50BC-432.58A2-287.08B2-281.08C2.

表2 响应面实验设计及结果

由表3可以看出，该回归模型是显著的(p=0.003 7<0.05)，失拟项(p=0.087>0.05)不显著.而模拟的回归系数(R2)为0.965 9，说明拟合度良好，实验中的误差小.在方差一次项中B的p<0.01，差异极其显著，而A和C的p>0.05，差异不显著.而二次项的影响中A2、B2、C2的p<0.01，所以其对Nisin效价影响极显著；AB、BC的交互作用p<0.05，说明其对Nisin效价的影响是显著的，AC的交互作用p>0.05，交互差异不显著.

表3 响应面值R(Nisin效价)的方差分析

注：“*”表示差异显著(p<0.05)；“**”表示差异极显著(p<0.01).

(a)发酵pH和培养温度对乳链菌肽效价影响的响应面图

(b)发酵pH和培养温度对乳链菌肽效价影响的等高线图图4 发酵液pH与培养温度对乳链菌肽效价的响应面图与等高线图

经过Design-expert处理后得到响应面的曲面和等高线的图如图4、图5、图6所示.由图4可以看出，发酵液pH与培养温度对Nisin效价存在相互交叉影响，且影响显著.响应面曲线口朝下说明在A和B交互作用下Nisin效价有最大值.图5中，发酵pH和发酵时间无交互作用.由图6可以看出，培养温度与发酵时间有交互作用，不过交互作用影响的显著性不强，而说明曲面口向下，B和C交互作用下Nisin效价有最大值.

(a)发酵pH和发酵时间对乳链菌肽效价影响的响应面图

(b)发酵pH和发酵时间对乳链菌肽效价影响的等高线图图5 发酵液pH与发酵时间对乳链菌肽效价的响应面图与等高线图

验证实验：通过响应面软件进行优化分析，得出嗜热乳链球菌6032 ACA液芯微囊发酵生产Nisin的最佳条件是：pH6.11、培养温度28.68 ℃、发酵时间20.19 h，Nisin效价为5 476.10 IU/mL.为检验实验的可行性，利用最优的发酵条件进行发酵实验，同时考虑到实际操作的便利，将最佳的发酵条件修正为pH6.1、培养温度28.7 ℃、发酵时间20 h，实际测得的Nisin效价为5 460.00 IU/mL，与理论值相差较小.说明响应面分析所得的优化模型是可靠的.

(a)培养温度和发酵时间对乳链菌肽效价影响的响应面图

(b)培养温度和发酵时间对乳链菌肽效价影响的等高线图图6 培养温度与发酵时间对乳链菌肽效价的响应面图与等高线图

3 结论

(1)采用制备的微胶囊进行发酵生产，微囊化发酵与游离细胞发酵对比，微囊化发酵具有较长的发酵周期，但Nisin的效价要高于游离细胞发酵.微囊化细胞生产Nisin能够反复使用12个批次，Nisin的效价稳定.

(2)在单因素实验的基础上，通过Box-Behnken中心组和试验设计分析发酵初始pH、培养温度、发酵时间对Nisin效价的影响，培养温度对Nisin效价的影响最大，其次是发酵pH，最后是发酵时间.且培养温度对响应值R(Nisin效价)的影响极显著.再把响应面软件分析结果进行优化分析，并进行可行性实验.

(3)通过响应面优化，确定嗜热乳链球菌6032 ACA液芯微囊发酵生产Nisin的最佳发酵条件为：发酵初始pH为6.1，培养温度为28.7 ℃，发酵时间为20 h.在此条件下Nisin的效价为5 460.00 IU/mL.经验证实验结果表明该模型适用于嗜热链球菌6032 ACA微囊发酵生产Nisin.

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【责任编辑：陈 佳】

Study on the fermentation conditions ofstreptococcusmicrocapsule cell for the production of Nisin

HE Xiao-xian1， WEI Jie-ru1， YU WEN Ya-huan1，2， ZHENG Mao-kui1， HU Jin1

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China； 2.School of Pharmacy, Shaanxi Institute of International Trade & Commerce, Xianyang 712046, China)

In order to enhance the production efficiency of Nisin,which was fermentation produced byStreptococcusThermophilus6032 ACA liquid core microcapsule cells,comparison fermentation effect of free cells and microcapsule cells,the different periods of the microcapsule cells wall were observed through the electron microscope,and the stability of the microcapsule cells were also ascertained.According to the Box-Behnken group and design principle based on single factor experiment,the fermentation conditions of producing Nisin by ACA liquid core microcapsule ofStreptococcusThermophilus6032 were optimized using response surface methodology.These experimental results showed that the fermentation titer of microcapsule cell was more higher than that of free cell,the fermentation stability was good in a certain period of time.With the extension of time,the microcapsule was destroyed,resulting to lower titer.The results showed that the optimal fermentation conditions were as follows: pH 6.1,the culture temperature of 28.7 ℃,the fermentation time of 20 h.Under these conditions,the titer unit of Nisin was 5 460.00 IU/mL,in which the experimental values of the titer of Nisin were closed to predicted value.These showed that it is effective for optimizing fermentation conditions of the ACA liquid core microcapsule ofStreptococcusThermophilus6032 producing Nisin using response surface methodology.

StreptococcusThermophilus; ACA liquid core microcapsule; Nisin; fermentation conditions; response surface methodology

2016-12-11

国家自然科学基金项目(59493300); 教育部博士学科点基金项目(9800462)

贺小贤(1962-)，女，陕西西安人，教授，研究方向:发酵工程、生物化工

2096-398X(2017)03-0132-06

TQ920.1

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