李裕民　龚逸鸿

摘要：【目的】明确调控生物材料表面拓扑结构对猪关节软骨细胞基础生长行为和功能的影响，为关节软骨组织缺损修复提供理论依据。【方法】利用食人鱼溶液（Piranha，H₂O₂H₂SO₄）对普通玻片进行氧化，以紫外光刻法制备具有不同尺度条带微图案的Si印模，经氧气等离子体处理和Ⅱ型胶原（COLⅡ）浸润后，通过微接触印刷（pCP技术）将COLⅡ固定在氧化玻片材料表面，将猪关节腔软骨细胞接种于微图案化的支架材料上，经37℃、5%COs培养箱培养后采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）比色法和二乙酸荧光素（FDA）荧光染色法分别观察软骨细胞的增殖生长情况。【结果】经食人鱼溶液处理后玻片表面羟基化程度提高，亲水性明显增强。通过pCP技术能成功将COLⅡ印刷在羟基化玻片表面上，且条带均匀、整齐。将猪软骨细胞接种到构建的取向性COLⅡ微图案材料上进行培养，发现COLⅡ能为猪软骨细胞提供黏附位点，且取向性COLⅡ微图案对软骨细胞的增殖生长有促进作用，但不同尺度（100、200和300μm）线宽对软骨细胞的增殖生长存在明显差异，表现为线宽越宽，软骨细胞的增殖生长能力越弱。猪软骨细胞在COLⅡ微图案材料上生长状况良好，随着培养时间的延长，软骨细胞多呈多边形；其软骨细胞培养效果优于无规则的涂覆COLⅡ微图案材料。【结论】利用μCP技术成功构建的规整COLⅡ微米级拓扑结构对猪关节软骨细胞的黏附铺展、增殖行为有促进作用，且线宽尺度与软骨细胞增殖生长能力呈反比趋势。即通过人为调控生物材料的表面活性拓扑结构，在一定程度上能有效调控或影响关节软骨细胞的生长行为。

关键词：猪；关节软骨细胞；Ⅱ胶原（COLⅡ）；微图案；微接触印刷（μCP技术）

中图分类号：S828 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）12-2273-08

0引言

【研究意义】关节软骨是一种无神经、无血管的组织，再生能力相对较差（Aigner and Stove，2003），缺损后常因自身修复能力有限而继发成骨关节炎。因此，研究软骨细胞的生长过程，掌握关节软骨自我修复发生规律尤为重要。目前，治疗软骨缺损的办法主要围绕自体软骨、异体软骨及人工生物材料展开研究。自体软骨移植的软骨源非常有限，且再次移植过程中存在二次损伤的风险（Miljkovic et al.，2008）；异体软骨移植的潜在免疫反应及感染率可能会导致治疗失败或效果不佳（ODriscoll，1998；Lee and Shin，2007）。人工生物材料能构建可调控的细胞生长环境，有目的地調控细胞的生长行为和功能，在体外通过组织工程方法大量扩增目标组织和细胞群用于修复病变缺损的软骨组织（Chen et al.，1997；Lehnert et al.，2004）。可见，利用组织工程学方法培养工程化软骨进行软骨移植具有重要意义。【前人研究进展】经过数年的发展，组织工程的概念也与时俱进，目前在基础研究、临床医学上已得到应用，甚至普及到商业化研发，如拇指再生术，即利用成骨细胞与多孔珊瑚支架复合在体外培养出与患者缺损部位相匹配的拇指（Vacanti et al.，2001）；Advanced TissueSciences公司研发出人工皮肤Dermagraft（Atala et al.，2006），并已商品化。此外，Zhang等（2008）在研究影响新生儿成骨细胞的生物活性时发现，壳聚糖与纳米HAP结合成的复合支架较壳聚糖支架更有利于骨的形成。Ortved等（2015）将转染IGF-Ⅰ基因的马软骨细胞与纤维蛋白材料复合植入关节软骨缺损处，8个月后缺损区以富含Ⅱ型胶原（COLⅡ）和软骨细胞的透明样软骨修复为主。随着现代科学技术的不断发展，表面改性技术已被广泛应用于材料科学研究领域，其中表面微结构构建技术尤其引人关注。从光学平版印刷（Bhatia et al.，1992）到溶液亲属性自组装（Maruyama et al.，1998），再到最新发展起来的软光刻技术（洪吉等，2001），一次次推动材料表面改性技术的深刻变革。1994年，Biebuyck和Whitesieds首次提出微接触印刷（简称μCP技术），其具有便捷、低耗的优点，可在微米、亚微米级尺寸上微图案化材料表面性质和结构，以实现小分子、聚合物、生物大分子等在材料表面的选择性吸附。Jacobs和White-sides（2001）在薄膜电介体上利用电场μCP技术成功捕获到亚微米级的电荷图案。上述研究结果为在人工生物材料上构建可调控的微纳米尺度图案提供了可行方案。【本研究切入点】至今，有关微米级拓扑结构对猪关节软骨细胞生长行为调控的研究鲜有报道，而针对关节软骨浅表层微环境仿生的研究更少。【拟解决的关键问题】通过μCP技术将COLⅡ固定在氧化玻片材料表面，制备一系列不同尺度的细胞外基质微图案，以期通过调控生物材料表面拓扑结构影响软骨细胞的基础生长行为和功能，为关节软骨组织缺损修复提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

Ⅱ型胶原酶（Collagenase Ⅱ）购自美国Gibco公司，二乙酸荧光素（FDA）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、罗丹明B乙硫氰酸酯（RBITC）和High Glucose-DMEM购自美国Sigma公司，硅片模板（100、200和300 gm）购自上海汶昌芯片科技有限公司。

1.2玻片表面羟基化处理

取直径1 cm的圆形玻片在乙醇、丙酮中分别超声波10 mind氮气吹干，去除污渍、油渍等。配制食人鱼（Piranha）溶液（H₂5O₄：H₂O₂=7：3，5：5，3：7），冷却至室温后放人干净玻片，置于通风橱中80℃加热4 h。以去离子水清洗玻片至溶液pH 7.0，保存待用。羟基化玻片用动、静态接触角测试仪测试接触角（θ）变化。

1.3 COLⅡ条带微图案构建

荧光标记COLⅡ溶液制备：将5.0 mL RBITC溶液（25 mg/L）与10.0 mL COLⅡ溶液（10 mg/L醋酸）充分混合，室温避光放置4 h，过滤后冻干，-20℃放置备用。采用μCP技术制备COLⅡ微图形的过程如图1所示，先用紫外光光刻法制备具有目的图案的Si印模，随后配制康道宁184聚二甲基硅氧烷（PDMS）胶体（质量比10：1），将PDMS胶体溶液均匀倒在si印模上，利用浇注固化法制备聚二甲基硅氧烷（PD-MS）印章，将固化的印章从印模上剥离并用乙醇与蒸馏水依次充分超声波清洗，干燥后置于氧气等离子体中反应1 min，并浸没在COLⅡ溶液（2 mmol/mL）中30 min，氮气缓慢吹干印章表面，再与氧化玻片充分接触40 min，取下印章，即获得COLⅡ微图案，最后用1%胃蛋白溶液封闭，PBS清洗2～3次，并以PS（链霉素—青霉素双抗）浸泡过夜。

1.4猪软骨细胞分离与培养

利用酶消化法提取猪关节腔软骨细胞，具体步骤如下：将关节面软骨切成1 cm²小块后用无菌PBS清洗3～5次，转移至75 cm²培养瓶中，加入Ⅱ型胶原蛋白酶（Collagenase Ⅱ，1 mg/mL），置于37℃、5%CO₂培养箱中消化1 6 h，5000 r/min离心5 min，弃上清液，将沉淀接种到软骨全培养基（20%FBS，10 mmol/L HEPES，50 mg/mL Vc，0.4 mmol/L L-proline，0.1 mmol/LNEAA，1%PS）中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。

1.5猪软骨细胞接种

在24孔培养板中，用0.5 mL全培养基浸润图案化处理所得的材料，每孔加1.0 mL细胞悬液（1.5×103/cm²），置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，隔天换液1次。

1.6猪软骨细胞增殖活力检测

取接种培养第1、3、5和7 d的猪软骨细胞用无菌PBS清洗2次，采用MTT比色法测定细胞活力。在避光条件下弃孔内培养液，加入5.0 mL灭菌培养液10倍稀释的MTT溶液（0.5 mg/mL），吹打细胞，重新置于培养箱中培养3～4 h。弃MTT溶液后每孔加入DMSO，摇床（80 r/min）摇匀15 min，于490 mm处测定吸光值。

1.7猪软骨细胞FDA免疫荧光染色

取接种培养7 d的猪软骨细胞，弃培养液后加入FDA溶液（5 mgm），37℃培养箱中静置20 min，无菌PBS清洗3次，荧光显微鏡下观察并拍照。

1.8猪软骨细胞细胞骨架染色

取培养接种7和14 d的猪软骨细胞，弃培养液后用4%多聚甲醛室温下固定45 min，1%Triton x-100浸泡5 min，以2.0 mL洗涤液清洗2次后加入封闭液，室温放置2 h。加入40.0μL一抗（Anti-vinculin），室温下摇床孵育1.5 h，再以2.0 mL洗涤液清洗3次，每次5 min；加入二抗和鬼比环肽混合液2.0 mL，室温孵育3.0 h；重复清洗3次后加入DAPI，室温下摇床孵育3 min，封闭液清洗后拍照。

2结果与分析

2.1玻片表面羟基化效果

由于玻片表面本身含有一定量的羟基，故清洁后的盖玻片具有一定亲水性，其接触角（θ）测试如图2所示。由表1可知，随着食人鱼溶液中H₂SO₄占比的提高，蒸馏水在玻片表面的接触角越小。当H2504与H202的比例由3：7变成7：3时，羟基化后的玻片平均接触角明显变小，其左接触角（θ_A）从16.63°降至8.01°、右接触角（θ_R）由17.19°降至9.36°，说明经食人鱼溶液处理后玻片表面羟基化程度提高，亲水性增强。此外，随着食人鱼溶液氧化时间的延长，玻片接触角逐渐变小，即玻片羟基化程度增加。

2.2 μCP材料在显微镜透射和反射模式下的形貌观察结果

图3是一套完整微图案模具在反射模式下的显微照片，其线间距均为100 pm，模板刻画的图案清晰。经浇筑法翻印的PDMS印章在显微镜透射模式下观察发现，以PDMS（10：1）浇筑后得到的印章边缘整齐，图案完整（图4），完全复刻了模板的图案形状，说明PDMS浇筑法制备印章成功。

2.3条带微图案荧光观察结果

玻片经食人鱼溶液氧化生成大量羟基，这些羟基能与胶原上的大量氨基交联，而促使胶原接枝在氧化玻片上。用RBITC荧光标记的COLII进行印刷，在波长265 nmqr可激发显示出红光。由图5可看出，μCP材料表面图案部分呈现明显且均匀的红色荧光，非图案部分无法观察到荧光，说明COLII通过μCP技术已成功印刷在羟基化玻片表面上，且条带均匀、整齐，可用于后续研究。

2.4条带微图案扫描电镜观察结果

采用SEM扫描电镜观察制备获得的取向性COLII条带喷金样品，发现其条带边缘清晰，图案完整（图6）。将100 μm COLII微图案视野放大，可观察到密集分布的条形纤维状物质，且呈一种相对有序的排列次序（图7）。

2.5猪软骨细胞接种黏附增殖情况

在羟基化玻片和完全涂覆COLII的玻片（无微图案）上分别接种猪软骨细胞（24孔板，1.5×10³/孔），接种培养第4、7和11 d在荧光显微镜下观察其荧光染色情况，对比两种不同材料对软骨细胞的黏附效果。图8为猪软骨细胞接种在羟基化洁净玻片表面的荧光染色照片，图9为猪软骨细胞接种在涂覆COLII玻片（无微图案）的荧光染色照片。对比发现，同一时间点下，涂覆COLII玻片（无微图案）的荧光染色信号明显强于羟基化洁净玻片，说明涂覆COLII的玻片（无微图案）更有利于猪软骨细胞的黏附和铺展。由此推测，COLII对软骨细胞起到提供黏附位点的作用，且能促进软骨细胞的增殖行为。

2.6猪软骨细胞的增殖活力

将猪软骨细胞接种到不同尺度（100、200和300μm）的取向性COLII微图案材料表面上培养，以无规则的涂覆COLII微图案为对照材料（CT），分别取培养第1、3、5和7 d的细胞进行MTT染色观察。结果显示，猪软骨细胞在两种材料上均能够正常增殖生长，但在取向性COLII微图案表面的长势整体上优于对照组（图10），说明取向性材料对软骨细胞的黏附和增殖能力有积极作用。此外，不同尺度（100、200和300μm）线宽对猪软骨细胞的增殖生长也存在明显差异，表现为线宽越宽，软骨细胞的增殖生长能力越弱，即100 μm线寬条带下的软骨细胞增殖能力最强。

2.7猪软骨细胞FDA免疫荧光染色结果

接种培养7 d的猪软骨细胞经FDA荧光染色后，于荧光显微镜下观察其增殖生长情况，结果显示，COLII微图案材料表面均呈现绿色荧光，且数量多、密度大（图11）；随着培养时间的延长，软骨细胞多呈多边形，说明软骨细胞在COLII微图案材料上生长状况良好。

2.8猪软骨细胞骨架染色结果

选取100μm线宽的取向性COLII微图案材料和无规则的涂覆COLII微图案材料（CT）进行对比，于猪软骨细胞培养7和14 d时进行细胞骨架荧光染色，结果（图12）发现，取向性COLII微图案材料上的软骨细胞铺展状况良好，细胞骨架清晰；而在无规则的涂覆COLII微图案材料上，软骨细胞数量偏少，且细胞铺展状况较差。

3讨论

由于软骨组织的天然环境结构，导致其修复再生能力较差，而现行的软骨缺损修复手段（异体软骨移植、骨膜移植术等）均存在一定缺陷（Yannas et al.，1989）。对于软骨组织工程来说，种子细胞、支架和生活环境是关键的三要素（Stoddart et al.，2009）。软骨细胞的增长必须依附于材料支架，而细胞所处的细胞外微环境在增殖生长代谢过程中时刻与软骨细胞相互作用（Darling et al.，2009），即软骨细胞的黏附、铺展、生长及蛋白表达等均与材料支架的表面性能相关联。胶原蛋白是细胞外基质的结构蛋白，软骨组织的细胞外基质主要是COLII（组织干重占比60%～70%）和蛋白糖聚集体（组织干重占比20%～40%），其他成分包括糖蛋白、脂类物质和软骨细胞。一旦软骨组织中的胶原蛋白含量降低，尤其在外界压力的作用下，关节磨碎加快；同时随着年龄增长、免疫力降低，关节软骨在炎症因子的作用下极易形成退行性关节炎。可见，COLII在维持正常软骨结构及功能方面具有不可忽视的作用。

目前，国内外学者多侧重于纳米级、亚微米级的图案化研究（Zhang et al.，2008；Ortved et al.，2015），有关微米级图案对细胞基本生长行为的调控研究较少。细胞与所处的微环境时刻都在相互作用，从仿生角度出发，在体外构建取向性图案，模拟天然关节软骨浅表层的胶原取向性排布，在一定程度上重现了浅表层软骨细胞生长的微环境，同时紫外光光刻图案线宽可进行人为调控，以此研究不同微环境对软骨细胞基本生长行为的影响，可为关节软骨组织缺损修复打下基础。本研究利用IaCP技术，在食人鱼溶液羟基化改性的玻片上制备100、200和300 gm3种线宽尺度的取向性COLII微图案化拓扑结构生物活性表面，接种猪软骨细胞进行培养，结果显示，COLII能为猪软骨细胞提供黏附位点，且取向性COLII微图案对软骨细胞的增殖生长有促进作用，同时微图案线宽越窄，软骨细胞的增殖生长能力越强。该结论为研究微米级拓扑结构对软骨细胞生长行为的影响提供了基础数据，但有关蛋白表达及百微米级别内的取向性拓扑图案对软骨细胞基础生长行为的影响仍有待进一步探究。

4结论

利用μCP技术成功构建的规整COLII微米级拓扑结构对猪关节软骨细胞的黏附铺展、增殖行为有促进作用，且线宽尺度与软骨细胞增殖生长能力呈反比趋势。即通过人为调控生物材料的表面活性拓扑结构，在一定程度上能有效调控或影响关节软骨细胞的生长行为。