金微瑛　童夏生　阮正英

[摘要] 目的 探討大鼠低氧性肺血管重塑时硫化氢对Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白在肺血管壁异常堆积的调节作用。 方法 购买首都医科大学实验动物中心提供的38只健康雄性Wistar大鼠，依据随机数字表法将大鼠分为低氧组（n=14）、低氧+硫氢化钠（NaHS）组（n=12）、对照组（n=12），建立大鼠HPH模型，监测其血流动力学，测定其血浆H2S含量，检测其肺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白，最后进行结果判定与半定量分析、统计学分析。 结果 低氧组大鼠的mPAP、RV/（LV+SP）均显著高于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05），血浆H2S含量显著低于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05），肺小型肌性动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达均显著高于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05）；低氧组、低氧+NaHS组、对照组大鼠肺中型肌性动脉Ⅰ型胶原蛋白表达逐渐降低（P<0.05），低氧组、低氧+NaHS组大鼠肺中型肌性动脉Ⅲ型胶原蛋白表达均显著高于对照组（P<0.05）。低氧组大鼠肺小型肌性动脉、肺中型肌性动脉Ⅰ型胶原mRNA表达均显著高于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05）；低氧组、对照组、低氧+NaHS组大鼠肺小型肌性动脉、肺中型肌性动脉Ⅲ型胶原mRNA表达均逐渐降低（P<0.05）。 结论 大鼠低氧性肺血管重塑时硫化氢能够有效抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及其mRNA在肺血管壁的表达，进而可能对低氧性肺血管重塑进行有效缓解，值得临床充分重视。

[关键词] 大鼠低氧性肺血管重塑；硫化氢；Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白；肺血管壁异常堆积；调节作用

[中图分类号] R543.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）36-0037-04

[Abstract] Objective To investigate the regulatory effects of hydrogen sulfide on abnormal accumulation of typeⅠand Ⅲ collagen in pulmonary vascular wall of rats with hypoxic pulmonary vascular remodeling. Methods A total of 38 cases of healthy male Wistar rats purchased from the experimental animal center of Capital Medical University， these rats were divided into hypoxia group （n=14）， hypoxia+sodium hydrosulfide （NaHS） group （n=12） and control group （n=12） according to the random number table method， rat model of HPH was established， hemodynamics was monitored， contents of H2S in plasma were determined， typeⅠand Ⅲ collagen in the lung tissues were detected， finally the results were determined and semi quantitative analyzed and statistically analyzed. Results The mPAP level， RV/（LV+SP） of the hypoxia group were significantly higher（P<0.05）， the content of plasma H2S was significantly lower （P<0.05）， the expression of typeⅠand Ⅲ collagen in pulmonary small muscular arteries were significantly higher than the hypoxia+NaHS group， control group（P<0.05）； The expressions of type Ⅰ collagen in lung and muscular artery of the hypoxia group， hypoxia+NaHS group， control group decreased gradually（P<0.05）， the expressions of type Ⅲ collagen in pulmonary muscular medium artery of the hypoxia group， hypoxia+NaHS group were significantly higher than the control group （P<0.05）. The expressions of type Ⅰ collagen mRNA in pulmonary small muscular arteries， medium-sized pulmonary muscular artery of the hypoxia group were significantly higher than the hypoxia+NaHS group， control group（P<0.05）； The expressions of type Ⅲ collagen mRNA in pulmonary small muscular arteries， medium-sized pulmonary muscular arteries of the hypoxia group， hypoxia group+NaHS group， control group were gradually decreased （P<0.05）. Conclusion Hydrogen sulfide can effectively inhibit the expressions of typeⅠand Ⅲ collagen and mRNA in pulmonary vascular wall， and it may be able to alleviate the pulmonary vascular remodeling of rats， so is worthy of the clinical full attention.

[Key words] Hypoxic pulmonary vascular remodeling of rats； Hydrogen sulfide； Collagen typeⅠand Ⅲ； Abnormal accumulation of pulmonary vascular wall； Regulation

低氧性肺动脉高压（HPH）的病理基础主要为肺血管重塑，而在低氧性肺血管重塑中，胶原重塑占有极为重要的地位，该领域的重要课题就是研究其调节机制[1]。以往临床普遍认为[2]硫化氢（H2S）属于毒性废气，最近临床发现[3]，心血管系统会内源性生成H2S，同时其具有重要的病理生理学效应，在调节心肺血管功能的过程中，H2S属于新型气体信号分子，能够在极大程度上缓解低氧诱导的肺血管重塑及肺动脉高压。本研究探讨了大鼠低氧性肺血管重塑时硫化氢对Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白在肺血管壁异常堆积的调节作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

2016年1～6月购买首都医科大学实验动物中心提供的38只健康雄性Wistar大鼠（批准号：091017），体重200～1800 g，平均（190±10）g，依据随机数字表法将大鼠分为低氧组（n=14）、低氧+硫氢化钠（NaHS）组（n=12）、对照组（n=12）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠HPH模型 低氧舱有缝隙相通于外界大气，能够为舱内气体以较慢的速度进出提供良好的前提条件，从而始终保持舱内气压和大气压的平衡。在进行低氧处理的过程中在低氧舱内放置大鼠，将氮气通入舱内，将舱内的部分氧气替换掉，从而有效降低舱内氧气浓度。用小风扇不断混匀舱内混合气体，采用上海雷磁公司生产的RSS-5100型氧浓度监测仪对舱内氧浓度进行随时监测，对向舱内注入的氮气流量进行控制，途径为对减压阀及气体流量表进行调节，保持舱内氧浓度为（10.0±0.5）%。在常压低氧舱内放置低氧组、低氧+NaHS组大鼠，舱内O2、N2分别占10%、90%，每天10：00～16：00连续低氧6 h，每天1次，共持续3周。低氧前给予低氧+NaHS组大鼠腹腔注射新鲜配置的14 μmol/kg H2S供体NaHS溶液，每天1次，给予低氧组、对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水。三组大鼠具有相同的饮食饮水条件。达到低氧性肺动脉高压大鼠诊断标准，提示造模成功。

1.2.2 血流动力学监测 完成低氧后给予大鼠腹腔注射1.2 g/kg体重乌拉坦麻醉，肺动脉、颈动脉插管分别对肺动脉平均压（mPAP）、体循环平均压（mAP）进行测定。将胸腔打开，取出心脏，分别对右心室（RV）、右心室（LV）+右间隔（SP）进行称量，然后计算RV/（LV+SP）。

1.2.3 血浆H2S含量测定 将0.5 mL 1%醋酸锌加入试管中，然后将0.1 mL血浆标本加入其中，混匀后将0.5 mL 30 mmol/L三氯化铁+0.5 mL 20 mmol/L对苯二胺盐酸盐加入其中，在室温下进行20 min的孵育，之后将1 mL 10%三氯醋酸沉淀蛋白加入其中，将2.5 mL蒸馏水加入其中将体积补足至5 mL，离心 5 min，将上清液吸出来，在670 nm处对上清液的吸光度（A）值进行检测，然后计算上清液中H2S含量，在此过程中运用亚甲蓝分光光度法，严格依据标准曲线。

1.2.4 肺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白检测 采用天津TBD公司生产的Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化试剂盒对肺组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白进行检测，采用武汉博士德公司生产的Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA原位杂交试剂盒对Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA原位杂交进行检测。

1.3 结果判定与半定量分析方法

阳性信号的标准为光学显微镜下棕黄色颗粒[4]。运用半定量积分方法分析肺血管壁Ⅰ、Ⅲ型胶原表达强度，随机检测每张切片中的10条肺小型、中型肌性动脉，外径分别在50 μm以下、50～150 μm之间[5]。

1.4 统计学分析

采用统计学分析软件SPSS10.0分析数据，计量资料用（x±s）表示，多组均数比较用单因素方差分析（ANOVA），用Bonferroni进一步进行组间比较，检验标准α=0.05。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠的血流动力学指标比较

低氧组大鼠的mPAP、RV/（LV+SP）均显著高于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05），但低氧+NaHS组、对照组大鼠的mPAP、RV/（LV+SP）之间的差异均不显著（P>0.05），三组大鼠的mAP之间的差异均不显著（P>0.05），见表1。

2.2 三组大鼠的血浆H2S含量比较

低氧组大鼠的血浆H2S含量[（192±22）μmol/L]显著低于低氧+NaHS组、对照组[（317±36）μmol/L、（302±32）μmol/L]（P<0.05），但低氧+NaHS组、对照组大鼠的H2S含量之间的差异不显著（P>0.05）。

2.3 三组大鼠肺动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达比较

低氧组大鼠肺小型肌性动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达均显著高于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05），但低氧+NaHS组、对照组大鼠肺小型肌性动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达之间的差异均不显著（P>0.05）；低氧组、低氧+NaHS组、对照组大鼠肺中型肌性动脉Ⅰ型胶原蛋白表达逐渐降低（P<0.05），低氧组、低氧+NaHS组大鼠肺中型肌性动脉Ⅲ型胶原蛋白表达均显著高于对照组（P<0.05），但低氧组、低氧+NaHS组大鼠肺中型肌性动脉Ⅲ型胶原蛋白表达之间的差异不显著（P>0.05），见表2。

2.4 三组大鼠肺动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达比较

低氧组大鼠肺小型肌性动脉、肺中型肌性动脉Ⅰ型胶原mRNA表达均显著高于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05），但低氧+NaHS组、对照组大鼠肺小型肌性动脉、肺中型肌性动脉Ⅰ型胶原mRNA表达之间的差异均不显著（P>0.05）；低氧组、对照组、低氧+NaHS组大鼠肺小型肌性动脉、肺中型肌性動脉Ⅲ型胶原mRNA表达均逐渐降低（P<0.05），见表3。

3讨论

低氧性肺血管重塑一方面包括细胞外基质的改变，另一方面也包括中膜平滑肌细胞的异常增殖。细胞外基质主要包括两种成分，一种为弹性蛋白，一种为胶原蛋白[6-8]。Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型等不同类型的胶原存在于血管壁中，其中血管壁的抗张力及韧性受Ⅰ型胶原直接而深刻的影响，而其弹性受Ⅲ型胶原直接而深刻的影响。在血管壁中，Ⅰ、Ⅲ型胶原占有极为重要的地位，在对血管的完整性维持方面发挥着极为重要的作用[9-13]。相关医学研究表明[14]，大鼠肺动脉羟脯氨酸（代表胶原）含量特异性在HPH形成的情况下提升，进而一方面在极大程度上提升Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达，另一方面也在极大程度上提升其前胶原mRNA。因此，在低氧性肺血管重塑中，血管壁内Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的异常沉积是重要的病理过程。

迄今为止，低氧性肺血管结构重塑的形成机制尚不清楚。气体信号分子如一氧化氮与一氧化碳具有快速产生、迅速弥散、作用广泛等生物学特性， 它们的发现将肺动脉高压发病机制研究带入了新的阶段。以往的研究提示[15-18]，一氧化氮和一氧化碳在低氧性肺血管结构重塑中发挥重要的调节作用。然而低氧性肺血管重塑的形成机制非常复杂，至今尚不明了。在诸多内源性生成的气体分子中，探寻对心肺血管调节具有重要作用的新型气体信号分子并揭示其对肺血管重塑的可能作用机制是该领域的重大前沿课题。本研究结果表明，低氧组大鼠的mPAP、RV/（LV+SP）均显著高于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05）；低氧组大鼠的血浆H2S含量[（192±22）μmol/L]显著低于低氧+NaHS组、对照组[（317±36）μmol/L、（302±32）μmol/L]（P<0.05）；低氧组大鼠肺小型肌性动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达均显著高于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05）；低氧组、低氧+NaHS组、对照组大鼠肺中型肌性动脉Ⅰ型胶原蛋白表达逐渐降低（P<0.05），低氧组、低氧+NaHS组大鼠肺中型肌性动脉Ⅲ型胶原蛋白表达均显著高于对照组（P<0.05）；低氧组大鼠肺小型肌性动脉、肺中型肌性动脉Ⅰ型胶原mRNA表达均显著高于低氧+NaHS组、对照组（P<0.05）；低氧组、对照组、低氧+NaHS组大鼠肺小型肌性动脉、肺中型肌性动脉Ⅲ型胶原mRNA表达均逐渐降低（P<0.05），与上述相关医学研究结果一致。已有研究报道[19]，内源性H2S在体内可能有两种存在形式，一种是气体H2S形式，另一种则可能以NaHS形式存在。以NaHS形式存在的H2S容易保证溶液中H2S浓度的稳定， 文献报道H2S的干预实验多使用NaHS溶液[20]，因此本实验中也采用了NaHS溶液来提供H2S。研究发现，补充NaHS后，大鼠血浆中H2S的含量升高，提示低氧时体内减少了的H2S得到了补充。

总之，大鼠低氧性肺血管重塑时硫化氢能够有效抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及其mRNA在肺血管壁的表达，进而可能对低氧性肺血管重塑进行有效缓解，值得临床充分重视。

[参考文献]

[1] 刘毅. SDF-1/CXCR4生物轴调控骨髓来源的血管平滑肌祖细胞参与低氧性肺血管重塑[D]. 第四军医大学，2010.

[2] 石海霞. 脱离低压低氧环境对大鼠低氧性肺血管重建的影响及氟西汀的干预作用[D]. 青海大学，2011.

[3] 揭伟. 循环平滑肌祖细胞在低氧性肺无肌细动脉肌化中的作用[D].华中科技大学，2009.

[4] 吴西玲. 低氧性肺动脉高压中亚硝基谷胱甘肽还原酶的表达及其调控机制的研究[D]. 浙江大学，2009.

[5] 张新. COPD合并肺间质纤维化HRCT评分与肺功能、TGF-β1、FGF-1的相关性研究[D]. 河北医科大学，2009.

[6] 陈建波. 埃他卡林對慢性低氧性肺动脉高压大鼠肺组织HIF-1αmRNA和蛋白表达的影响[D]. 南京医科大学，2009.

[7] 何创. Caveolin-1对内毒素性肺损伤TGF-β1/Smads信号通路的调控[D]. 广州中医药大学，2012.

[8] 郝淑玲. 肾上腺髓质素及其受体在肺成纤维细胞中的表达及抗纤维化作用的研究[D]. 第三军医大学，2012.

[9] 时全星. U50488H对低氧性肺动脉高压内皮功能的改善作用及其机制研究[D]. 第四军医大学，2012.

[10] 李柏完 ，蒋永亮，戴爱国. TGF-β1诱导成肌纤维细胞形成在低氧性肺血管重塑中的作用[J]. 基础医学与临床，2008，11（3）：232-237.

[11] 殷广，罗颖. 成纤维细胞活化在低氧性肺血管重构中的作用[J].心脏杂志，2013，20（6）：716-718，725.

[12] 颜金花，樊海宁，格日力. 硫化氢在低氧性肺动脉高压发病中的作用[J]. 生理科学进展，2008，39（4）：359-361.

[13] 刘毅，牛雯，张博，等. SDF-1/CXCR4生物轴调控骨髓来源的血管平滑肌祖细胞参与低氧性肺血管重塑[J]. 中国病理生理杂志， 2010，2（10）：2003.

[14] Xu Dunquan. The Preventive Roles and Mechanisms of Estrogen on Hypoxic Pulmonary Hypertension in Rats[D]. The Fourth Military Medical University，2014.

[15] Lv Ying. The Role of Kv1. 5Channel in Hypoxic Pulmonary Arterial Hypertension Following Intrauterine Growth Retardation and Its Epigenetic Mechanism[D]. Zhejiang University，2014.

[16] Church Alistair C，Martin Damien H，Wadsworth Roger，et al. The reversal of pulmonary vascular remodeling through inhibition of p38 MAPK-alpha：A potential novel anti-inflammatory strategy in pulmonary hypertension[J].AJP：Lung Cellular and Molecular Physiology，2015， 309（4）：L333-L347.

[17] Christophe Guignabert，Carole Phan，Andrei Seferian，et al. Dasatinib induces lung vascular toxicity and predisposes to pulmonary hypertension[J]. Journal of Clinical Investigation，2016，126（9）：3207-3218.

[18] Robert von Arx，Yves Allemann，Claudio Sartori，et al. Right ventricular dysfunction in children and adolescents conceived by assisted reproductive technologies[J]. Journal of Applied Physiology， 2015， 118 （10）：1200-1206.

[19] Congcong Zhang. Different Concentrations of Notoginsenoside Rg1 Attenuate Hypoxic and Hypercapnia Pulmonary Hypertension by Reducing the Expression of ERK in Rat PASMCs[J]. Advances in Biological Chemistry，2016，6（1）：12-18.

[20] Wang Jian，Fu Xin，Yang Kai，et al. Hypoxia inducible factor-1-dependent up-regulation of BMP4 mediates hypoxia-induced increase of TRPC expression in PASMCs[J].Cardiovascular Research， 2015，107（1）：108-118.

（收稿日期：2016-09-11）