陈宝伶

[摘要] 目的 探讨弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）Bcl-2蛋白的表达，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和微血管密度（microvessel density，MVD）的相关性，研究弥漫性大B细胞淋巴瘤Bcl-2蛋白与血管新生的关系。 方法 采用免疫组织化学染色方法（EnVison）检测弥漫性大B细胞淋巴瘤患者和对照组淋巴结组织中VEGF、Bcl-2、MVD表达情况。 结果 弥漫性大B细胞淋巴瘤患者Bcl-2蛋白、MVD、VEGF 阳性表达均明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。对三者进行两两相关性分析，结果显示MVD与VEGF表达呈正相关，Bcl-2蛋白阳性表达与VEGF表达呈正相关，Bcl-2蛋白阳性表达与MVD表达呈正相关。 结论 VEGF的高表达可以促进肿瘤细胞增殖能力及侵袭能力，可促进Bcl-2蛋白高表达，同时加上本身促血管生成的作用，可降低弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞凋亡，从而增加弥漫性大B细胞淋巴瘤的恶性程度，既而增加了弥漫性大B细胞淋巴瘤的治疗难度。

[关键词] 弥漫性大B细胞淋巴瘤；血管内皮生长因子；血管新生；B细胞淋巴因子2蛋白；免疫组织化学

[中图分类号] R733.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）36-0032-05

[Abstract] Objectives To investigate the relationship among the expression of Bcl-2 protein， VEGF and MVD and discuss the relationship between angiogenesis and Bcl-2 in diffuse large B cell lymphoma. Methods Immunohistochemical assay（EnVison） was performed to test the VEGF， Bcl-2 and microvessel density in diffuse large B cell lymphoma and control group. Results The expression of Bcl-2， MVD and VEGF in diffuse large B cell lymphoma was significantly higher than control group （P<0.01）. VEGF expression was correlated with MVD in diffuse large B cell lymphoma. Bcl-2 expression was correlated with VEGF in diffuse large B cell lymphoma， Bcl-2 expression was correlated with MVD in diffuse large B cell lymphoma. Conclusion High expression of VEGF can improve the proliferation and invasion ability of tumor cell. VEGF can improve the expression of Bcl-2， lower diffuse large B cell lymphoma cell′s death， and increase malignant extent of diffuse large B cell lymphoma， VEGF plays an important role in angiogenesis， then can increase angiogenesis and remedial difficulty of diffuse large B cell lymphoma.

[Key words] Diffuse large B cell lymphoma； Vascular endothelial growth factor（VEGF）； Angiogenesis； B cell lymphoma 2 protein； Immunohistochemical assay

弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤中最常见的一类侵袭性淋巴瘤[1]。目前发现在淋巴瘤、骨髓瘤及急性白血病等患者的骨髓中存在不同程度的血管新生（Angiogenesis），血管新生可能參与了肿瘤的发生及发展过程[2]。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管新生中最主要的调控因子，可诱导大部分恶性肿瘤的血管新生，刺激肿瘤细胞的生长[3]。B细胞淋巴瘤因子2（Bcl-2）是细胞凋亡研究中最受重视的癌基因之一。在细胞凋亡过程中及肿瘤多重耐药形成中均起着重要的作用。

随着对弥漫性大B细胞淋巴瘤研究的深入发展，目前对其病理诊断、治疗和残留病灶的诊断评价等诸多方面均有了较大的发展，但仍有部分患者疗效较差，因此为了更好地预测患者在治疗过程中病情的发展及制定个体化治疗方案，本文应用免疫组织化学技术回顾性分析弥漫性大B细胞淋巴瘤血管新生与Bcl-2蛋白的表达及其之间的联系，为临床上对弥漫性大B细胞淋巴瘤的诊断治疗及预后提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究对象为2009年9月～2014年9月我院患者淋巴结标本经病理组织学明确诊断的初治的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者35例，诊断标准参照WHO（2008）关于造血与淋巴组织肿瘤分类[4]进行，男18例，女17例，年龄12～67岁，平均45岁。原发灶均位于淋巴结内，以颈部为主。纳入标准：①符合弥漫性大B细胞淋巴瘤的诊断标准；②取材良好，无污染；③淋巴结蜡块完整，可重复切片；④切片后应用免疫组织化学染色方法染色效果好的淋巴结组织样本。排除标准：①不符合弥漫性大B细胞淋巴瘤的诊断标准（例如非霍奇金淋巴瘤分型）；②取材差，淋巴结组织少；③淋巴结蜡块不完整，不能切片或切片后，贴片不理想。④染色效果差，免疫组化过程中出现掉片、脱片。

在同一时间段收集35例良性淋巴结反应性增生的患者淋巴结标本作对照观察（因反复咳嗽，颈部包块疼痛等原因就诊的患者），男17例，女18例，年龄14～69岁，平均44岁。纳入标准：①因反复咳嗽，颈部包块疼痛等原因就诊的患者，经淋巴结涂片病理活检不符合弥漫性大B细胞淋巴瘤的淋巴结；②取材良好，无污染；③淋巴结蜡块完整，可重复切片；④切片后应用免疫组织化学染色方法染色效果好的淋巴结组织样本。排除标准：因有文献报道肾素血管紧张素系统的表达可促进血管新生，可能与VEGF生成水平有关，故对照组所有患者排除以下情况：①排除高血压、糖尿病、心力衰竭、严重的肝肾疾病等与肾素血管紧张素（RAS）有关的疾病，无浮肿、脱水。②排除服用ACEI（血管紧张素转换酶抑制剂）、ARB（血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂）类药或停用1周以内的患者，服用可能影响RAS药物（两性霉素B、β受体阻滞剂）的患者；②取材差，淋巴结组织少；③淋巴结蜡块不完整，不能切片或切片后，贴片不理想。④染色效果差，免疫组化过程中出现掉片，脱片。

全部标本均为常规用10%中性福尔马林固定、石蜡包埋的归档蜡块。连续4 μm切片，分别行免疫组化染色。

1.2 试剂与方法

1.2.1 试剂 兔抗人VEGF多克隆抗体；PV-9000通用型二步法免疫组化检测试剂盒；兔抗人FⅢ因子多克隆抗体；鼠抗人Bcl-2单克隆抗体，均购于福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2.2 免疫组化染色方法 ①石蜡切片至水，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。②进行高压热修复抗原，20 min后冷却至室温。③3% H2O2室温避光孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗，2 min×3次。④分别滴加适量的兔抗人VEGF多克隆抗体、兔抗人FⅧ因子多克隆抗体、鼠抗人Bcl-2单克隆抗体工作液，37℃孵育2 h，PBS冲洗，2 min×3次。⑤滴加聚合酶辅助剂于37℃孵育20 min，PBS冲洗，2 min×3次。⑥滴加辣根酶标记羊抗兔多聚体试剂于37℃孵育20 min，PBS冲洗，2 min×3次。⑦PBS冲洗，2 min×3次。⑧加DAB显色剂显色；⑨自来水充分冲洗、苏木精衬染、脱水透明、中性树脂封片。均以胞浆内出现明显的棕黄色细颗粒为阳性判断标准。设0.01 mmol/LPBS代替一抗作为阴性对照；省略一抗为空白对照。

1.3 结果判定标准

VEGF、Bcl-2陽性染色定位于细胞浆，大多呈弥漫分布，呈棕黄色颗粒，随机选择10个高倍视野，取其平均值计算阳性细胞数。FⅧ因子的染色结果用于计数微血管密度（microvessel density，MVD）。以微血管计数代表血管新生，先用低倍（×100）镜观察，寻找微血管最多的热点区域，然后用高倍镜（×400）计数5个视野，求其平均值作为MVD。微血管可为单个或一簇棕色的细胞，可有或无管腔。凡血管直径大于8个红细胞或血管壁带有明显肌层及纤维硬化，炎症及坏死区的微血管均不能计入总数[5]。

1.4 统计学分析

所有资料均用SPSS19.0 for windows统计学软件包进行统计分析。计量资料组间比较采用t 检验，计数资料采用χ2检验，Bcl-2、微血管密度与血管内皮生长因子表达采用直线相关分析，即Pearson法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 弥漫性大B细胞淋巴瘤组与对照组Bcl-2、VEGF及MVD阳性率的测定

2.1.1 Bcl-2蛋白阳性率测定 Bcl-2蛋白表达于细胞浆，呈棕黄色颗粒。弥漫性大B细胞淋巴瘤组为（78.88±4.15）%，对照组为（14.52±3.43）%，弥漫性大B细胞淋巴瘤组明显高于对照组（P<0.01），见封三图1～4。

2.1.2 VEGF阳性率的测定 VEGF表达于细胞浆，呈棕黄色颗粒。弥漫性大B细胞淋巴瘤组为（56.88±3.15）%，对照组为（11.53±2.03）%，弥漫性大B细胞淋巴瘤组明显高于对照组（P<0.01），见封三图5～8。

2.1.3 MVD的测定 在免疫组织化学的结果中，可见淋巴结中微血管内皮细胞胞浆被染成棕黄色，多数血管具有明显的管腔， 部分为无管腔的内皮细胞团块和单个内皮细胞。MVD 结果显示，弥漫性大B细胞淋巴瘤组为（20.83±4.37）/×400倍视野，对照组为（5.84±1.25）/×400倍视野，弥漫性大B细胞淋巴瘤组明显高于对照组（P<0.01），见封三图9～12。

2.2 Bcl-2 阳性率测定、MVD、VEGF含量相关比较

在弥漫性大B细胞淋巴瘤组，MVD与VEGF呈正相关（r=0.745，P<0.01），Bcl-2蛋白阳性率与VEGF呈正相关（r=0.762，P<0.01），Bcl-2 蛋白阳性率与 MVD 呈正相关（r=0.831，P<0.01）。

2.3免疫组化结果

3 讨论

弥漫性大B细胞淋巴瘤占临床所有B细胞淋巴瘤的50%左右，占成人非霍奇金淋巴瘤（non Hodgkin's lymphomas，NHL）的30%～40%，是NHL中最常见的一个类型[6，7]。它的治疗历经了几十年的转变，从单一放疗到目前的放、化疗相结合方案，但部分患儿治疗后缓解情况仍不理想。因此寻找合适的标志物进行合理分析和预后评估，对临床治疗加以指导，具有重要意义。

弥漫性大B细胞淋巴瘤在临床表现、组织形态、预后等多方面有很大异质性及侵袭性，属中、高度恶性肿瘤[8]。弥漫性大B细胞淋巴瘤可见于各个不同年龄阶段，具有随年龄的增长而发病率逐渐升高的趋势，研究结果发现男性略高于女性。DLBCL可以是原发，也可以是由其他类型的侵袭性淋巴瘤如边缘区淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤（follicular lymphomas，FLs）或白血病（如慢性淋巴细胞性白血病）转化而来[9]。DLBCL是以无痛性、进行性淋巴结肿大（最常见为颈部淋巴结、锁骨上淋巴结和腋窝淋巴结）为首要临床表现，当我们发现症状后，有些已经到了晚期，例如发生于胸、腹腔脏器（肝脏、脾脏、胃肠道、甲状腺、扁桃体等）的肿大淋巴结压迫脏器而出现声音嘶哑、吞咽困难、呼吸困难等相应症状时，晚期患者还可出现发热、乏力、盗汗、消瘦等全身症状。该型淋巴瘤临床表现复杂多样，病情进展迅速且缺乏规律，同时容易发生远处转移，故预后较差[10]。

目前研究结果表明Bcl-2蛋白在临床分期和免疫类型中可以独立作为弥漫性大B细胞淋巴瘤预后因子[11-12]。Bcl-2基因是一种原癌基因，能抑制细胞凋亡。Bcl-2蛋白是Bcl-2致癌基因的产物，它既参与抑制细胞凋亡，也参与细胞增生的调控过程，是重要的细胞凋亡基因及调节蛋白，对于延长细胞寿命起重要作用。本实验研究显示Bcl-2阳性表达显著高于对照组。进一步证实了基因的紊乱在DLBCL的发病中起重要作用。Bcl-2基因在肿瘤中可过度表达，从而抑制细胞凋亡，改变肿瘤细胞的生物学行为，Bcl-2抑制细胞凋亡可能与以下几个方面有关：①Bcl-2蛋白可抑制内质网管中Ca2+的释放，使细胞内Ca2+浓度升高，从而抑制凋亡[13]；②H2O2在Bcl-2半胱氨酸氧化作用中作为一个潜在的因素直接调节细胞凋亡[14]；也有学者认为Bcl-2可通过抗氧化剂或抑制氧自由基的产生而发挥其抑制细胞凋亡的功能[15]；③Bax系Bcl-2家族中最具代表性的促细胞凋亡蛋白，当细胞中Bcl-2增多时，则易与Bax形成异源二聚体，从而抑制细胞凋亡，Bax可对Bcl-2表达进行调节，其表达水平增加可拮抗Bcl-2的作用，促进细胞凋亡[16]，相反则抑制细胞凋亡；④目前研究发现Bcl-2半胱氨酸可通过ERK信号对体外细胞的凋亡进行调节，在免疫沉淀作用和共聚焦显微镜下发现Bcl-2与胞外信号调节激酶ERK1/2形成Bcl-2-ERK复合物而抑制细胞凋亡，这种相互作用是由Bcl-2半胱氨酸调节的。但因在DLBCL的分型中表达情况不同，故DLBCL患者可出现不同的临床表现，从而在发现Bcl-2基因异常表达时，可提示Bcl-2基因表达可以用来作为DLBCL的不良临床过程、疗效差的指标。同样国外大量研究显示，MYC和Bcl-2高表达，提示弥漫性大B细胞淋巴瘤患者预后较差[17-18]。

肿瘤的发生需要血管形成，血管形成在肿瘤生长、浸润及转移方面均起着重要的作用。而肿瘤血管的新生是一个十分复杂的过程，Sharma S等[19]指出MVD最重要的价值在于能够反映一些实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤的生长、转移和侵袭，并且是预测肿瘤复发和生存的一个重要指标。目前用来判断预测 DLBCL缓解情况的结果表明DLBCL与新生血管之間存在密切的关系。血管新生在肿瘤的发病过程中起重要作用。但却是一个涉及多种细胞多种分子的复杂过程。血管新生存在多种的病理生理过程，在恶性肿瘤的生长、浸润、转移过程中起重要作用。肿瘤的侵袭播散与细胞外基质的降解和肿瘤的血管生成密切相关。本实验也发现DLBCL患者的淋巴结病理组织切片中肿瘤细胞均大量增多，病理切片中有核细胞数及微血管数增生活跃，尽管增生程度有所不同，但均高于对照组。血管新生受多种因子调控，其中功能最强、特异性最高的是血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），它能够促进内皮细胞分裂、增殖和血管构建、迁移，增加血管通透性[20]。除决定肿瘤血管生成外，VEGF还具有一定的免疫调节功能，能够降低机体内的免疫监视功能，从而促进免疫逃逸[21，22]。研究[23]证实：高度恶性的肿瘤细胞中多存在VEGF高表达和自分泌机制，即肿瘤组织分泌VEGF，而VEGF又通过促进肿瘤组织新生血管的生成，加速肿瘤生长。结内恶性淋巴瘤的部分研究[24]显示了恶性淋巴瘤细胞中VEGF对推测预后有意义。但目前PGI-DLBCL与VEGF相关性的研究较少。镜下观察结果显示：VEGF既表达于肿瘤细胞，也表达于其周围组织，说明肿瘤及其周围细胞均能分泌VEGF[25]，考虑随着肿瘤生长活跃，肿瘤内血管显著增生，血管新生肿瘤细胞的营养和物质代谢依赖于微血管，而MVD是反映血管增生及代谢活跃的重要指标。本研究应用免疫组化技术，并用FⅧ因子标记血管内皮细胞，对MVD进行了分析，结果发现弥漫性大B细胞淋巴瘤组均明显高于对照组，而且VEGF和MVD存在正相关，这与国内外多数学者报道相一致，表明血管新生在弥漫性大B细胞淋巴瘤发生过程中具有重要作用，血管新生程度高，则疾病进展快，预后相对较差，与继往研究[26]结果相仿。以上结果表明DLBCL与新生血管之间存在密切关系，本研究发现，弥漫性大B细胞淋巴瘤患者Bcl-2蛋白、MVD、VEGF 阳性表达均明显高于对照组，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）。且结果MVD与VEGF表达呈正相关，Bcl-2蛋白阳性表达与VEGF表达呈正相关，Bcl-2蛋白阳性表达与MVD表达呈正相关。通过对这三者进行两两相关性分析，临床中我们也发现在治疗Bcl-2阳性的DLBCL患者时，化疗后病情会反复，考虑应给予更加强烈的化疗方案，以取得更高的缓解率。Pidgeon CP等[27]发现，VEGF的表达促进了癌细胞中Bcl-2的高表达，而抗VEGF抗体抑制了Bcl-2的高表达，从而抑制肿瘤的生长，促进了肿瘤细胞的凋亡。在弥漫性大B细胞淋巴瘤中，VEGF的高表达可以促进肿瘤细胞增殖能力及侵袭能力，VEGF的高表达，可促进Bcl-2蛋白高表达，同时加上本身促血管生成的作用，可降低弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞凋亡，从而增加弥漫性大B细胞淋巴瘤的恶性程度，既而增加了弥漫性大B细胞淋巴瘤的治疗难度。

综上所述，本研究认为，在弥漫性大B细胞淋巴瘤的不同分型中，促血管新生的调节因子的分泌水平不同，但发现淋巴瘤中仍有较多血管新生，因本实验样本含量少，尚有待于更多的样本去研究。

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（收稿日期：2016-08-23）