曲辅政，张晓录，孙经武，刘现亮，王东，史孟松，王秀花，曲爱燕，路新磊，周红霞，程林，康浩飞，衣晓蕊，刘静

基础与实验研究

缬沙坦对心力衰竭家兔心肌细胞肌浆网兰尼碱受体的影响

曲辅政，张晓录，孙经武，刘现亮，王东，史孟松，王秀花，曲爱燕，路新磊，周红霞，程林，康浩飞，衣晓蕊，刘静

目的：探讨家兔慢性心力衰竭(心衰)时心肌细胞肌浆网兰尼碱受体（RyR2）表达及其释钙功能的改变以及血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂缬沙坦长期干预的意义。

方法：27只家兔随机分为三组：假手术组（n=9）、心衰组（n=9）和缬沙坦组（n=9），通过超容量负荷联合压力负荷建立家兔心衰模型，于术后7周观察左心室结构、血流动力学的变化及心肌细胞肌浆网RyR2的表达和功能的改变。

结果：与假手术组比较，心衰组左心室重量指数、左心室舒张末压显著升高（P＜0.05），左心室短轴缩短率及左心室射血分数明显降低（P＜0.05）；与心衰组比较，缬沙坦组左心室重量指数、左心室舒张末期压力显著降低（P＜0.05），左心室短轴缩短率及左心室射血分数明显升高（P＜0.05）；心衰组心肌细胞肌浆网RyR2表达和其释钙功能显著低于假手术组（P＜0.05）；缬沙坦组心肌细胞肌浆网RyR2表达和其释钙功能显著高于心衰组（P＜0.05）。

结论：长期应用缬沙坦能够改善心脏舒缩功能，可能与其增加心肌细胞肌浆网RyR2表达和其释钙功能有关。

心力衰竭；肌浆网；兰尼碱受体钙释放通道

心力衰竭（心衰）是临床常见的危重症之一，死亡率高，严重威胁患者的生命。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（ARB）可选择性作用于心脏AT1受体，逆转心室和血管壁的重构，促进心脏功能的恢复[1]。研究表明，心肌细胞肌浆网兰尼碱受体（ryanodine receptor2，RyR2）的异常在心衰的发病机制中发挥重要作用[2]。目前国内鲜有关于心衰时心肌细胞肌浆网RyR2的变化以及缬沙坦进行长期干预对心功能影响的报道。本实验通过用超容量负荷联合压力负荷建立家兔心衰模型，进而观察缬沙坦对心肌细胞肌浆网RyR2表达和功能的影响，从而探讨缬沙坦改善心功能的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物和材料

家兔27只，雌雄不限，体重2.0～2.2 kg，由苏州大学医学院实验动物中心提供。SCHILLER TM-7型有创血压监护仪产自瑞士，Taq DNA聚合酶及逆转录试剂盒为立陶宛Fermentas公司产品，聚合酶链式反应（PCR）引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成，低温离心机产自德国，PCR仪（Touchgene Gradient）产自英国，Bio Rad电泳转印仪产自美国，KPL 蛋白免疫印迹法（western blot）试剂盒产自美国，BCA蛋白浓度测定试剂盒购于上海西唐生物公司，RyR2一抗购于美国ABR公司，β-肌动蛋白（β-actin）一抗购于美国Upstate公司, 二抗羊抗兔IgG购于上海西唐生物公司， Fura-2·pentapotassium salt购于瑞士Alexis公司，胡萝卜内酯和乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）购于德国Sigma公司，LAMBDADG-4 Ca2+浓度荧光测定仪购于美国，IX71倒置显微镜购于日本。

1.2心衰模型的建立

家兔经心脏超声检查，排除器质性病变后，随机分为假手术组（n=9）、心衰组（n=9）、缬沙坦组（n=9）。心衰组、缬沙坦组家兔利用超容量负荷联合压力负荷建立心衰模型[3,4]，缬沙坦组家兔在主动脉关闭不全后第2天开始给予缬沙坦20 mg/（kg·d）。术后7周心脏超声测定左心室短轴缩短率（LVFS）及左心室射血分数（LVEF），左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD）利用心导管术测定左心室收缩末期压力（LVESP）、左心室舒张末期压力（LVEDP）；然后处死家兔，取出心脏，剪下左心室心肌组织称重，获得左心室重量（LVW），计算左心室重量指数（LVMI），心肌组织于-70℃保存备用。

1.3半定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）

根据Genebank的序列，并参考相关文献，分别设计RyR2及内参照β-actin的引物序列。RyR2正义引物：F-AACACATGCCCAACGACAC，反义引物：AAGTAAACCCTCTCGATGCGT；β-actin正义引物：F-CTTCTCCTTGATGTCCCGCACGAT，反义引物：R-GTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGG 。 用Trizol提取心肌的总RNA，逆转录成ucDNA，-20℃保存。PCR反应体积为50 μl，含RT产物2 μl，10×buffer 5 μl,上下游引物各0.5 μmol/L，dNTP200 μmol/L，MgCl21.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶2.5 U。反应程序为93℃ 预变性3 min，然后进入PCR循环，93℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环30次再延伸7 min。RyR2与β-actin扩增片段长度分别为130、231 bp。RT-PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，用Bio Rad凝胶成像系统quantity one软件分析条带灰度，计算RyR2与β-actin扩增条带灰度比。

1.4蛋白表达的测定

蛋白提取：取左心室肌组织标本100 mg，剪碎，置于离心管中，加入细胞裂解液及蛋白酶抑制剂，用高速匀浆器打碎，4℃离心800 g，5 min；取上清液置于超速离心管中，4℃离心12 000 g，1 h；弃上清，沉淀物为膜蛋白，用BCA法测定蛋白浓度[5]，-70℃保存。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：取含20 μg总蛋白的样本，于100℃煮沸5 min，用非连续梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白（RyR2分子量为565 kD，分离胶浓度为6%，浓缩胶浓度为3%）；首先电压100 V、15 min直到样品在浓缩胶底部成一直线，然后电压200 V、180 min至溴酚蓝到达分离胶底部。

Western blot：在冰水中将凝胶上的蛋白电转移到硝酸纤维膜上，电压110 V、75 min；然后硝酸纤维膜置于封闭液中，室温温育1 h；再加入一抗（RyR2抗体滴度为1：500、β-actin抗体滴度为1：1000）封闭，4℃冰箱过夜。次日用洗液漂洗；再加入1：10000二抗（二抗为羊抗兔IgG），温育1 h；然后用洗液漂洗。最后将显色剂LumiGLO A液和B液1:1混合，直接加到硝酸纤维膜上；1 min后将显色液用吸水纸吸干，放入暗盒，加盖一层透明薄膜，曝光2 min。

蛋白表达半定量分析：将胶片扫描至计算机内，应用UVIDoc成像仪进行蛋白条带灰度分析；RyR2与β-actin灰度比值表示蛋白表达半定量水平。

1.5心肌细胞肌浆网提取步骤：

参照改良的Jones等[6]的方法制备肌浆网。（1）取液氮中黄豆至花生米大小的心肌组织，剪碎后置入离心管中，加入5倍体积的缓冲液A[30 mmol/L Tris-马来酸缓冲液，0.3 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF），2 mmol/L二硫苏糖醇（DTT），3 mmol/L MgCl2，0.1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），pH=7.2]，用匀浆器将它们匀浆，然后用2层和4层纱布分别过滤1次；（2）4℃，3 800 g离心20 min；（3）取上清液，移入新离心管中，4℃，14 000 g离心20 min；（4）取上清液，移入新离心管中，4℃，45 000g离心60 min；（5）弃上清液，收集沉淀，用缓冲液B（30 mmol/L Tris-马来酸缓冲液，0.3 mol/L蔗糖，0.1mmol/L PMSF，2 mmol/L DTT，0.5 mol/L KCl，pH=7.0）1 ml悬浮，用匀浆器打匀，4℃，45 000 g离心60 min；（6）收集沉淀，用缓冲液C（30 mmol/L Tris-马来酸缓冲液，0.3 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L PMSF，2 mmol/L DTT，pH=7.0）1 ml悬浮，用匀浆器充分混匀以形成肌浆网囊泡，蛋白含量的测定采用BCA法。

1.6RyR2释钙功能的测定[7]

（1）取反应液（Tris-HCl 20 mmol/L，KCl 100 mmol/L，MgCl25 mmol/L，NaN35 mmol/L，草酸钾 5 mmol/L，CaCl20.1mmol/L，pH=6.8）2 ml与肌浆网囊泡蛋白15 μg/ml、Fura-2 2 μm/L，室温下避光在玻璃培养皿放置5 min；（2）把玻璃培养皿放在倒置显微镜下，打开LAMBDADG-4 Ca2+浓度荧光测定仪，激发波长设为340 nm和380 nm，发射波长设为510 nm，然后分别以340 nm和380 nm的波长激发，510 nm发射，在避光条件下记录荧光强度的变化以及R值（340 nm荧光强度/380 nm荧光强度比值）的变化；（3） 荧光强度平稳后加入ATP-2Na 4 μm/ml触发反应，测定R比值；（4）再加入1 μm/L肌浆网钙泵抑制剂毒胡萝卜内酯（thapsigargin）和1 mmol/L EGTA诱导钙释放，15 s后再测定R值；（5）RyR2释钙能力的计算：[Ca2+]=Kd×（Rt-Rmin）/（Rmax-Rt） ×Sf2/Sb2（Kd为Fura-2对Ca2+的离解常数，Rt为Fura-2在t时间的荧光强度比值，Rmin为Fura-2在没有Ca2+的游离时的荧光强度比值，Rmax为Fura-2在饱和Ca2+的荧光强度比值，Sf2/Sb2为380 nm处游离时Fura-2与饱和Fura-2荧光强度比值）。

1.7统计学分析

2 结果

2.1三组家兔血流动力学和心功能比较（表1）

家兔饲养过程中，心衰组有3只不明原因死亡，缬沙坦组有2只死亡，发生在3周左右；假手术组无死亡，各组取6只作比较。心衰组解剖时可见皮下、胸腔、腹腔大量积水，而假手术组、缬沙坦组无以上表现；术前3组家兔手术前血流动力学和心功能比较无明显差别。术后7周，与假手术组相比，心衰组LVW、LVMI、心率、LVEDD、LVESD、LVEDP、LVESP显著升高，LVFS及LVEF明显降低；缬沙坦组的LVW、LVMI、心率、LVEDP、LVESP、LVEDD、LVESD显著低于心衰组，LVFS及LVEF明显高于心衰组。

表1 三组家兔术前、术后7周血流动力学和心功能指标比较

表1 三组家兔术前、术后7周血流动力学和心功能指标比较

注：LVW：左心室重量；LVMI：左心室重量指数；LVEDD：左心室舒张末期内径；LVESD：左心室收缩末期内径；LVEDP：左心室舒张末期压力；LVESP：左心室收缩末期压力；LVFS：左心室短轴缩短率；LVEF：左心室射血分数。与假手术组比*P＜0.05；与心衰组比△P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

指标 假手术组 (n=6) 心衰组 (n=6) 缬沙坦组 (n=6)术前LVW (g) 2.43±0.12 2.45±0.15 2.40±0.14 LVMI (g/kg) 1.30±0.07 1.33±0.05 1.35±0.02心率 (次/min) 244.80±10.90 242.00±5.40 247.67±3.78 LVEDD (mm) 14.52±1.42 15.80±2.47 15.70±1.04 LVESD (mm) 8.56±0.78 10.10±1.96 8.98±0.86 LVEDP (mmHg) -1.00±0.89 -1.17±0.75 -0.50±1.05 LVESP (mmHg) 113.17±4.75 111.17±2.64 112.83±4.17 LVFS (%) 41.35±3.75 37.50±3.41 41.86±2.67 LVEF (%) 74.22±2.97 76.57±2.82 74.70±2.36术后7周LVW (g) 2.48±0.15 7.15±0.59* 4.82±0.21△LVMI (g/kg) 1.32±0.06 3.61±0.09* 2.07±0.14△心率 (次/min) 244.67±9.39 270.50±2.88* 252.67±3.50△LVEDD (mm) 13.33±1.79 21.40±2.53* 17.58±1.96△LVESD (mm) 8.3±11.43 17.17±2.14* 11.53±0.99△LVEDP (mmHg) -0.50±1.05 23.00±2.37* 2.17±0.72△LVESP (mmHg) 112.67±3.78 139.50±3.08* 122.17±0.75△LVFS (%) 37.83±3.58 17.38±3.13* 33.83±2.85△LVEF (%) 71.92±4.56 38.50±6.07* 64.45±3.66△

2.2三组家兔心肌细胞肌浆网RyR2 mRNA水平比较（图1）

与假手术组相比，心衰组的RyR2 mRNA水平显著下降（灰度比：0.86±0.12 vs 0.70±0.06，P＜0.05），而缬沙坦组的RyR2 mRNA水平明显高于心衰组（灰度比：0.70±0.06 vs 0.50±0.03，P＜0.05），差异均有统计学意义。

图1 逆转录聚合酶链式反应分析家兔手术7周后心肌细胞肌浆网RyR2 mRNA表达的电泳图

2.3三组家兔心肌细胞肌浆网RyR2蛋白的比较（图2）

心衰组心肌RyR2蛋白表达显著低于假手术组（灰度比：0.73±0.03 vs 0.90±0.02，P＜0.05），缬沙坦组显著高于心衰组（灰度比：0.90±0.02 vs0.46±0.01，P＜0.05），差异均有统计学意义。

图2 3组家兔心肌细胞肌浆网RyR2蛋白印迹结果

2.4三组家兔心肌细胞肌浆网RyR2释钙功能的比较

用肌浆网外液加入胡萝卜内酯和EGTA后Ca2+浓度升高的百分比表示心肌细胞肌浆网RyR2摄钙能力，心衰组肌浆网RyR2释钙功能明显低于假手术组 [（20.16±1.28）% vs （45.32±1.92）%， P＜0.05]，缬沙坦组肌浆网RyR2释钙功能显著高于心衰组[（33.51±2.13）% vs（20.16±1.28）%， P＜0.05]。

3 讨论

RyR是一种钙离子释放通道，根据不同的组织分布，RyR分为三类: RyR1、RyR2和RyR3，在心肌细胞中分布的主要是RyR2。大量证据表明，钙循环异常在心衰的发展中起着重要作用[8]。钙循环主要包括肌浆网钙释放、钙回摄及钙储存三个过程。钙释放是由肌浆网RyR2完成。心肌细胞膜除极化，引起电压依赖性L型通道开放，少量钙离子内流入细胞质，成为肌浆网钙离子释放触发器。cAMP依赖的蛋白激酶A（PKA）或钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）对RyR2磷酸化，激活RyR2通道，使与其紧密结合的通道稳定蛋白（Calstabin2，FKBP12.6，FK506结合蛋白）解离，肌浆网内的钙离子大量释放，钙离子与肌钙蛋白结合，引起心肌收缩。大多研究显示心衰时RyR2的表达和活性是降低的[9]。RyR2表达及活性降低将直接导致肌浆网释放钙减少，心肌收缩下降，进而导致心衰。

本研究显示，7周后心衰组家兔均表现为不同程度的进食和活动减少，呼吸频率增快；LVW、LVMI、LVEDP明显增加；LVFS及LVEF明显降低；解剖时可见皮下、胸腔、腹腔大量积水。以上结果表明，心衰组家兔在超容量负荷及压力负荷的影响下，结构上表现为心室重构，功能上表现为收缩功能降低，最终发展为左心衰竭。与假手术组相比，心衰组RyR2的表达和活性显著降低，肌浆网的释钙能力下降，与以往的报道一致[10]。

国外研究表明血管紧张素Ⅱ可以引起心衰心肌的RyR2表达和功能降低[11-13]。国内姚艳等[14]研究氯沙坦长期干预心衰，能够改善心脏舒缩功能,可能与其上调肌浆网的钙调控蛋白 SERCA2、RyR2、PLB 的基因表达有关。

本实验研究表明缬沙坦长期干预心衰，可明显增加RyR2的表达和活性，提高肌浆网的释钙能力，显著改善血流动力学，缓解心室肥厚。缬沙坦作为一种ARB类药物，主要通过与AT1受体结合，竞争性抑制血管紧张素Ⅱ的生物学效应而发挥作用。具体机制可能包括以下因素：（1）缬沙坦作为血管扩张剂降低了心脏的前后负荷，降低了室壁的张力，改善了促使心室重构的血流动力异常；（2）抑制了心肌细胞凋亡、肥大和胶原的增生；（3）抑制了交感神经的过度激活；（4）增强了血管紧张素Ⅱ受体的良性心血管效应；（5）抑制了炎症因子等；（6）抑制RAS系统，增加了RyR2的表达和功能；（7）抑制了心衰时肌浆网钙调控相关蛋白的改变，恢复钙介导的兴奋-收缩耦联等[15,16]。

总之，本实验研究结果表明，心衰家兔RyR2的表达和活性降低，肌浆网的释钙能力下降，从而影响心肌舒缩功能，这将为心衰治疗提供新的方向。缬沙坦长期干预心衰，改善心脏舒缩功能，可能与其增加RyR2的表达和活性，提高肌浆网的释钙能力有关。

[1] Dalal J, Low LP, Van Phuoc D, et al. The use of medications in the secondary prevention of coronary artery disease in the Asian region. Curr Med Res Opin，2015, 31: 423-433.

[2] Dobrev D, Wehrens XH. Role of RyR2 phosphorylation in heart failure and arrhythmias: Controversies around ryanodinereceptor phosphorylation in cardiac disease. Circ Res, 2014, 114: 1311-1319.

[3] 邹操, 刘志华, 赵彩明, 等. 超容量负荷联合压力负荷制备家兔心衰模型的可行性探讨. 实验动物与比较医学, 2005, 25: 211-214.

[4] 曲辅政,刘志华，蒋彬, 等.辛伐他汀对心力衰竭家兔蛋白激酶A及磷酸酶1的影响.中国循环杂志, 2008, 23: 302-305.

[5] Huang T, Long M, Huo B. Competitive Binding to Cuprous Ions of Protein and BCA in the Bicinchoninic Acid Protein Assay. Open Biomed Eng J, 2010, 4: 271-278.

[6] Jones LR, Simmerman HK, Wilson WW, et al. Purification and characterization of phospholamban from canine cardiac sarcoplasmic reticulum. J Biol Chem, 1985, 260: 7721-7730.

[7] Escobar AL, Perez CG, Reyes ME, et al. Role of inositol1,4,5-trisphosphate in the regulation of ventricular Ca(2+) signaling in intact mouseheart. J Mol Cell Cardiol, 2012, 53: 768-779.

[8] Okuda S, Yano M. Excitation-Contraction coupling and intracellular calcium cycling in failing hearts. Clin Calcium, 2013, 23: 471-480.

[9] Ather S, Respress JL, Li N, et al. Alterations in ryanodine receptors and related proteins in heart failure. Biochim Biophys Acta, 2013,1832: 2425-2431.

[10] Marx SO, Marks AR. Dysfunctional ryanodine receptors in the heart: new insights into complex cardiovascular diseases. J Mol Cell Cardiol,2013, 58: 225-231.

[11] Edwards A, Pallone TL. Mechanisms underlying angiotensin II-induced calcium oscillations. Am J Physiol Renal Physiol, 2008, 295: F568-584.

[12] Zarain-Herzberg A, Estrada-Avilés R. Regulation of sarco(endo) plasmic reticulum Ca2+-ATPase and calsequestrin gene expression in the heart. Can J Physiol Pharmacol, 2012, 90: 1017-1028.

[13] Xie L, Lin P, Xie H, et al. Effects of atorvastatin and losartan on monocrotaline-induced pulmonary artery remodeling in rats. Clin Exp Hypertens, 2010, 32: 547-554.

[14] 姚艳, 黄从新, 陈高, 等. 氯沙坦对心力衰竭兔肌浆网钙调控蛋白的影响. 中华心血管病杂志, 2006, 34: 793-796.

[15] Turan B, Vassort G. Ryanodine receptor: a new therapeutic target to control diabetic cardiomyopathy. Antioxid Redox Signal, 2011, 15:1847-1861.

[16] Kushnir A, Marks AR. The ryanodine receptor in cardiac physiology and disease. Adv Pharmacol, 2010, 59: 1-30.

Impact of Valsartan on Sarcoplasmic Reticulum Ryanodine Receptor2 in Myocardiocyte of Heart Failure Rabbits

QU Fu-zheng, ZHANG Xiao-lu, SUN Jing-wu, LIU Xian-liang, WANG Dong, SHI Meng-song, WANG Xiu-hua, QU Ai-yan, LU Xin-lei, ZHOU Hong-xia, CHENG Lin, KANG Hao-fei, YI Xiao-rui, LIU Jing.
Department of Cardiology, Yantai Affiliated Hospital of Bin Zhou Medical College, Yantai (264100), Shandong, China Corresponding Author: SUN Jing-wu, Email: bysjw@163.com

Objective: To explore sarcoplasmic reticulum ryanodine receptor2 (RyR 2) expression and calcium releasing function in chronic heart failure (CHF) rabbits and to study the impact of long term valsartan treatment in relevant animals.

Methods: HF model was established by volume overloading with pressure overloading in experimental rabbits. 27 rabbits were divided into 3 groups: Sham group, HF group and HF+valsartan group. n=9 in each group and the animals were treated for 7 weeks. Left ventricular structure, hemodynamic parameters, expression and functional changes of myocardiocyte sarcoplasmic reticulum RyR 2 were observed and compared among different groups.

Results: Compared with Sham group, HF group had increased left ventricular mess index (LVMI), left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) and decreased left ventricular shortening fraction, LVEF, all P＜0.05. Compared with HF group, HF+valsartan group showed decreased LVMI, LVEDP and increased left ventricular shortening fraction, LVEF, all P＜0.05. Sarcoplasmic reticulum RyR 2 expression and calcium releasing function were lower in HF group than Sham group, P＜0.05; while they were both higher in HF+valsartan group than HF group, P＜0.05.

Conclusion: Long term application of valsartan could improve the cardiac function which might be related to increased myocardial sarcoplasmic reticulum RyR 2 expression and calcium releasing function in experimental CHF rabbits.

Heart failure; Sarcoplasmic reticulum; Ryanodine receptor calcium release channel

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:390.)

2016-05-10）

（编辑：许菁）

264100 山东省烟台市，滨州医学院烟台附属医院 心内科（曲辅政、孙经武、刘现亮、王东、史孟松、王秀花、曲爱燕、路新磊、周红霞、程林、康浩飞、衣晓蕊、刘静）；烟台毓璜顶医院 检验科（张晓录）

曲辅政 副主任医师 博士 主要从事心力衰竭的发病机制研究 Email: qufuzheng2005@126.com 通讯作者：孙经武 Email: bysjw@163.com

R54

A

1000-3614（2017）04-0390-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.04.019