李鹏辉++费洪新++王立红++许惠玉++张海燕

[摘要] 目的 构建PDCD5基因真核表达载体，并电转染BGC823细胞，获得稳定转染细胞。 方法 设计合成PDCD5基因片段，将其插入经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA3.1+表达载体，菌落PCR和基因测序进行鉴定。重组质粒电转染BGC823细胞，G418筛选数周后PCR鉴定稳定转染细胞。 结果 重组质粒经菌落PCR测序分析表明，PDCD5基因序列准确插入预期位置，且序列正确。重组质粒成功电转染BGC823细胞，并整合入细胞基因组DNA。结论 成功构建了PDCD5基因真核表达载体，并整合进BGC823细胞基因组，为研究PDCD5基因的功能及胃癌的基因治疗提供实验基础。

[关键词] PDCD5基因；pcDNA3.1+表达载体；电转染；BGC823细胞系

[中图分类号] R394 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）06-0033-03

[Abstract] Objective To construct eukaryotic expression vector of PDCD5 gene and transfect BGC823 cells to obtain stable transfected cells. Methods The PDCD5 gene fragment was designed and inserted into pcDNA3.1+ expression vector which was digested with EcoR Ⅰ and Xho Ⅰ. Colony PCR and sequencing were used for identification. The recombinant plasmid was electrically transfected into BGC823 cells， and PCR was used for identifying the stably transfected cells after G418 screening for weeks. Results It was suggested by colony PCR and sequencing analysis that the recombinant plasmid PDCD5 gene sequenc was accurately inserted into the desired position and the sequence was correct.Recombinant plasmids were successfully transfected into BGC823 cells and integrated into cell genomic DNA. Conclusion The eukaryotic expression vector of PDCD5 gene is successfully constructed and integrated into BGC823 cell genome， which provided experimental basis for studying the function of PDCD5 gene and gene therapy of gastric cancer.

[Key words] PDCD5 gene； pcDNA3.1+ expression vector； Electrical transfection； BGC823 cell line

程序性细胞死亡因子5（programmed cell death 5，PDCD5）原名为TFAR19，由北京大学人类疾病基因中心从白血病细胞株TF-1细胞中克隆得到，具有促进多种细胞凋亡和抑制增殖的效应，其异常表达与多种肿瘤及自身免疫性疾病有相关性[1]。研究表明，PDCD5基因在胶质瘤细胞[2]、前列腺癌细胞[3]、结肠癌[4]和胃癌[5]等多种恶性肿瘤组织中较正常组织表达水平下降，并且重组人PDCD5蛋白可以增强软骨肉瘤细胞[6]和肺癌细胞[7]等肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其5年生存率低于20%，是全球第二个癌症死亡相关的原因，而我国每年因胃癌死亡病例占全球人口的47.8%[8]。本研究以PDCD5基因和BGC823胃癌细胞为研究对象，构建pcDNA3.1+-PDCD5重组真核表达载体，电转染BGC823细胞，并筛选稳定转染细胞株，为进一步研究PDCD5基因的功能及进行胃癌的基因治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

BGC823细胞株和pcDNA3.1+质粒由齐齐哈尔大学生命科学与农林学院邵淑丽教授惠赠；DNA回收试剂盒及细胞基因组DNA提取试剂盒由武汉金开瑞生物技术有限责任公司提供；RPMI 1640培养基干粉购于Gibco公司；胎牛血清、DNA Marker及各种工具酶购于上海生工；ECM830型电穿孔仪购于美国BTX公司。

1.2 方法

1.2.1 PDCD5基因和引物的合成 PDCD5基因序列由NCBI数据库提供的资料确定，并在序列5端和3端分别添加EcoRⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点，序列全长383bp，连同pcDNA3.1+表达载体通用引物（pcDNA3.1-F：CTAGAGAACCCACTGCTTAC；pcDNA3.1-R：TAGAAGGCACAGTCGAGG）均送交武汉金开瑞生物技术有限公司合成。实验时间为2015年6月～2016年6月。

1.2.2 重組载体的构建 将pcDNA3.1+载体用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切37℃、3 h；80℃、20 min。用EcoRⅠ单酶切质粒作比对，电泳回收线性载体片段。用T4 DNA连接酶连接双酶切载体与PDCD5基因16℃，12 h，反应体系中双酶切载体和PDCD5基因的摩尔比为1∶3。

1.2.3 重组载体的转化及鉴定 将连接产物转化DH5α感受态大肠杆菌，涂布于含60 μg/mL Amp的LB筛选平板上，37℃培养12～16 h。挑取部分转化单菌落，以pcDNA3.1+载体通用引物进行菌落PCR：94℃预变性2 min；94℃ 变性30 s，55℃ 退火30 s，72℃延伸45 s，共34个循环；72℃ 延伸1 min，4℃保存。以未转化的DH5α菌落作阴性对照，以pcDNA3.1+质粒作阳性对照。将经菌落PCR鉴定正确的菌落进行扩大培养，测序鉴定。

1.2.4 重组质粒电转染BGC823细胞 BGC823細胞于37℃、5% CO2、饱和湿度培养。取处于对数生长中晚期细胞，用无血清1640培养基调整细胞密度至5×106 个/mL，取400 μL加入0.4 cm电转杯，加入经线性化的重组载体30 μg，冰浴10 min，于185 V、30 ms电击，电击后冰浴10 min，将细胞移至培养瓶中培养。

1.2.5 转染细胞的筛选和检测 转染细胞培养48 h后，以含500 μg/mL G418的培养基筛选培养8 d，以含250 μg/mL G418的培养基维持培养16 d后，收获稳定转染细胞。根据试剂盒说明提取稳定转染细胞基因组DNA，以载体通用引物进行PCR反应：94℃预变性2 min；94℃ 变性45 s，55℃ 退火45 s，72℃ 延伸45 s，共34个循环；72℃ 延伸3 min，4℃保存。以重组质粒作阳性对照，以未经转染细胞基因组作阴性对照。

2 结果

2.1 重组载体的构建

pcDNA3.1+质粒的酶切产物电泳图显示（封三图4），单酶切产物大小约为5500bp，双酶切产物略小于单酶切产物，两者的条带位置基本一致，与预期结果相符。pcDNA3.1+质粒的电泳结果表现为复制中间体、开环、超螺旋等2～3条与线性DNA Marker不完全相对应的电泳条带，见封三图4。

2.2 重组载体的鉴定

转化单菌落PCR扩增产物，经电泳分析发现扩增出561bp大小的条带，与期望条带大小一致，未转化大肠杆菌DH5α 菌落没有扩增产物，pcDNA3.1+质粒的引物扩增片段大小为211bp。在检测结果中随机选择3个阳性克隆重复扩增，结果稳定（封三图5）。经抗性平板和菌落PCR鉴定正确的阳性克隆的测序结果与合成序列一致，说明目的基因已正确插入载体，成功构建重组质粒（图1）。

2.3 转染细胞的PCR鉴定

提取转染细胞基因组，以载体通用引物作PCR扩增，电泳显示，扩增出561bp大小的条带，与阳性对照扩增产物大小相同，阴性对照没有扩增产物，与预期结果一致。见封三图6。

3 讨论

胃癌是严重危害我国人民健康的恶性肿瘤之一，其早期确诊率较低，死亡率较高是胃癌临床诊断和治疗的突出特点。采用手术切除胃癌组织的方法治疗中晚期胃癌，往往难以达到满意的治疗效果，因此化疗是中晚期胃癌的主要治疗手段，但是化疗药物的临床应用常导致多药耐药等反应，造成肿瘤细胞对化疗药物的不敏感而难免复发和转移。目前，多种靶向关键细胞信号传导途径的分子靶向疗法越来越受到抗肿瘤研究人员的重视，其对于增强化疗效果具有重要意义。

PDCD5基因是由北京大学人类疾病基因中心1999年在国际上首先报道的一个人类新基因，由白血病细胞株TF-1细胞中克隆得到。PDCD5的mRNA除了在造血系统外，在成人的心脏、肾脏、肾上腺、睾丸及胎盘中高度表达，其中胚胎组织的表达低于成年组织，肿瘤细胞的表达低于正常细胞[9]。PDCD5具有促进细胞凋亡的功能，主要定位于细胞核内，其高表达在促细胞凋亡过程中有重要作用，并且研究发现PDCD5是凋亡促进剂，而不是凋亡诱导剂[10，11]。基于大样本数据的分析表明，PDCD5基因的表达变化与胃癌的发生发展密切相关，其有可能成为一种胃癌诊断与治疗的新靶点[12]。为进一步研究PDCD5基因在胃癌细胞中的作用，本研究构建PDCD5基因真核表达载体，并电转染BGC823细胞。

在重组载体构建中，双酶切pcDNA3.1+质粒，获得与设计的合成的PDCD5基因片断具有相同粘性末端的线性载体，PDCD5基因片断定向连接到载体中，转化大肠杆菌感受态细胞，并利用质粒的Amp抗性基因筛选阳性转化子。挑取抗性平板上的单菌落，直接进行PCR检测重组质粒，省去了质粒提取的繁琐操作，避免了DNA制备过程中的某种试剂对扩增带来的不良影响，能够较为准确、快速的筛选出阳性克隆[13，14]。

外源DNA可通过瞬时转染和稳定转染两种方式导入真核细胞。瞬时转染可以获得目的基因暂时的高水平表达，转染的DNA不必整合进宿主染色体，而稳定转染的目的基因则整合到染色体DNA中，并利用外源DNA上带有的抗性基因筛选稳定转染细胞。本实验选用的pcDNA3.1+质粒携带neo基因，能够高效表达分解G418的抗性产物—氨基糖苷磷酸转移酶，从而使细胞能在含有G418的筛选培养基中生长。

虽然环状与线状DNA均可电穿孔转染，但线性DNA无论瞬时表达还是稳定转染的水平都要高一些[15]。因此，本研究将构建的pcDNA3.1+-PDCD5重组质粒线性化后电转染，经G418筛选获得重组质粒随机整合到宿主细胞基因组中的稳定转染BGC823细胞，进而为后续研究PDCD5基因在胃癌细胞中的功能，以及胃癌的诊断和治疗提供实验基础。

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（收稿日期：2016-11-23）