杨华锋+纪术峰+李占文+唐鲁兵+史国军+钟镇铧+范凤凤+刘纯

[摘要] 目的 探讨马齿苋生物碱对乳腺癌裸鼠肿瘤的抑制作用。 方法 利用体外培养高、低转移的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7细胞，并将两组癌细胞体外培养后移植于裸鼠体内，观察马齿苋生物碱对肿瘤细胞的抑制效率。比较各组肿瘤组织瘤重，计算肿瘤生长抑制率；通过病理切片HE染色观察各组肿瘤组织病理学变化，并通过高效液相色谱分析肿瘤组织对马齿苋生物碱的亲和力。利用ELISA检测方法分析肿瘤局部组织VEGF的表达水平。 结果 马齿苋MDA-MB-231组和马齿苋MCF-7组肿瘤体积明显缩小，MCF-7组和MDA-MB-231组肿瘤体积较马齿苋干预组明显增大，差异有统计学意义（P=0.000）。马齿苋生物碱干预乳腺癌裸鼠后，病理显示肿瘤细胞减少，并伴有肿瘤坏死和调亡。实验结果显示肿瘤组织对马齿苋生物碱有较高的亲和力。同时研究还显示马齿苋生物碱对肿瘤的VEGF有显著的抑制作用（P=0.000）。 结论 马齿苋生物碱能有效抑制乳腺癌细胞的生长，调控肿瘤细胞代谢，可能有望成为乳腺癌的新的治疗方法和手段。

[关键词] 马齿苋；乳腺癌；高效液相色谱；血管表皮生长因子

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）06-0025-05

[Abstract] Objective To study the inhibitory effect of alkaloids from purslane on breast cancer in nude mice. Methods Human breast cancer cell lines MDA-MB-231 with high metastatic rate and MCF-7 cells with low metastatic rate were cultured in vitro. And the two cancer cell lines were transplanted in nude mice after being cultured in vitro. The inhibitory effect of purslane alkaloids on tumor cells was observed. The tumor growth inhibition rate was calculated by comparing tumor weight of tumor tissue. The histopathological changes of the tumor tissues were observed by HE staining， and the affinity of the tumor tissue to the alkaloid of the purslane was analyzed by high performance liquid chromatography （RP-HPLC）. The expression level of VEGF in local tissue was analyzed by ELISA. Results The tumor volume of purslane MDA-MB-231 group and purslane MCF-7 group was significantly reduced， and the tumor volume of MCF-7 group and MDA-MB-231 group was significantly higher than that of the control group， and the difference was significant（P=0.000）. After purslane alkaloid intervention of breast cancer in nude mice， the pathology showed the reduction of tumor cells， accompanied by tumor necrosis and apoptosis. The results showed that the tumor tissue had high affinity for the purslane alkaloid. At the same time， it was also shown that the purslane alkaloid had a significant inhibitory effect on VEGF（P=0.000）. Conclusion Purslane alkaloids can effectively inhibit the growth of breast cancer cells， and regulate the metabolism of tumor cells， which may be expected to become a new treatment methods and means of breast cancer.

[Key words] Purslane； Breast cancer； High performance liquid chromatography； Vascular epidermal growth factor

馬齿苋（purslane）为马齿苋科草本植物，近年来国内外研究者对马齿苋的成分进行了药理分析，结果发现马齿苋具有多种活性成分，具有抗肿瘤活性，同时可以提高人体免疫力、改善人体内环境、调节人体机能状态。既往研究发现马齿苋多糖对肿瘤细胞有明显的抑制作用，但有关马齿苋对乳腺癌的抗肿瘤作用研究报道较少，本课题主要利用人乳腺癌细胞株（MDA-MB-231和MCF-7），进行体外培养，然后移植于裸鼠乳腺组织内，使肿瘤在裸鼠体内分裂增殖，将分离提取的马齿苋生物碱作用于荷瘤裸鼠，观察马齿苋生物碱对在体乳腺癌细胞增殖的影响，并通过病理学分析和肿瘤组织对马齿苋生物碱的亲和力以及肿瘤组织血管表皮生长因子（VEGF）表达进行研究，探讨马齿苋生物碱抗乳腺癌的作用，为乳腺癌的治疗寻找新的途径。

1 资料与方法

1.1 试剂与仪器、细胞株及实验动物

Dimethyl Sulfoxide、Luminol、P-Coumaric Acid、Paraformaldehyde、Poly Ethyleme Glycol、Glass Beads Acidwashed、Lithium Acetate Dehydrate、MOPS均购于SIGMA公司；NP-40、QRT-PCR试剂盒（购于日本TaKaRa）；ECL、HYBOND-PVDF膜、G418、DMEM干粉、RPMI1640干粉、胎牛血清、Regular-Agarose G-10（均购于Gibco公司）；Leupeptin Hemisulfate、Aprotinin均购于Merck公司；叠氮酸钠、钒酸钠（购于广州维嘉科技有限公司）；高氯酸、无水氯化钠（购于天津市鑫源化工有限公司）；柠檬酸三钠、硫酸铵、盐酸、苯酚（购于上海新高化学试剂有限公司）；乙腈色谱纯试剂、氫氧化钠（购于武汉强松精细化学品有限公司）；Sodium orthovanadate购于CALBIOCHEM公司；Liprofectamine 2000、Trizol、PI、Annexin-V、DCFH-DA、Trypan Blue/Hepes、Geneticin、Lipofectamine 2000、Opti MEM（均购自Invitrogen）；新鲜马齿苋于2015年9月购于浙江省杭州市农贸市场，经浙大医学院药学院教研室鉴定。用清水洗净，沥干水分，60°C鼓风干燥 6 h，粉碎备用。细胞培养箱（Thermo，ShellLab）。超净工作台（Esco sve-4A1）；T-75培养瓶、T-100培养瓶（购自威佳公司）；倒置荧光显微镜（Olympus）；倒置相差显微镜（Eclipse TS100-F）；BILON92-IID（温控型）超声波细胞粉碎机（上海比朗仪器有限公司）；Waters 510 液相色谱泵、Waters Nova2Pak ODS 色谱柱（3.9 mm×150 mm）、Waters Nova2Pak ODS保护柱（均购于Waters中国有限公司）；Shimadzu RF551荧光检测器、CF 16RX低温离心机（均购于日本）；Millipore过滤器、0.45 μm滤膜、METTLER TOLEDOAE240电子天平、LT.9MACIMSYSPULS整体荧光成像系统（均购于美国）；SEPU3010专用软件（江苏国达科技有限公司）；MDA-MB-231和MCF-7细胞株购自上海细胞库。SFP Balb/c裸小鼠，4～6周龄，雌性，体重16～18 g，购自南方医科大学实验动物中心。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 MDA-MB-231和MCF-7细胞株购自广州市中山大学细胞库，用10%灭活Gibico血清，100 U/mL青霉素+链霉素的DMEM细胞培养基（高糖型），恒温37℃、5%CO2饱和湿度条件下将MDA-MB-231和MCF-7细胞株置于培养箱内培养，用0.4%胎盼蓝经拒染法检测培养基内活细胞率>95%以上。

1.2.2 马齿苋生物碱的分离提取 马齿苋生物碱的分离提取参照参文[1]的方法。简述如下：将烘干后的的新鲜马齿苋草用药物粉碎机将其粉碎成粉末状，取200 g马齿苋草粉末，加1000 mL无水乙醇，40°C温度下搅拌机搅拌1 h，滤膜过滤，收集滤液；然后剩余滤渣中再次加入600 mL的无水乙醇，同上方法，40℃条件下搅拌机搅拌1.5 h。滤膜过滤，收集滤液保存，滤渣中再加600 mL的无水乙醇，40°C条件下搅拌半个小时。滤膜过滤，收集滤液，将3次收集的滤液混合。放置旋转蒸发仪中挥发尽乙醇，乙醇挥发干后余留黑色浸膏。在黑色浸膏中加10%的硫酸溶液100 mL，浸膏溶解后，过滤。用氨水溶液调节pH=10，再加入饱和NaCl水溶液20 mL（72 g NaCl，200 g）。用氯仿溶液萃取5次（1/5原液体积），置通风橱中将氯仿挥发干净。实验时加入10%乙醇溶解，配制成溶液使用。

1.2.3 裸鼠乳腺癌动物模型的建立 MDA-MB-231和MCF-7细胞的接种：以含10%胎牛血清PRMI-1640培养MDA-MB-231和MCF-7细胞，收集对数生长期的MDA-MB-231和MCF-7细胞，500 rpm离心后，弃上清，以Hanks液洗涤2次，在无血清PRMI-1640重悬，调节浓度适宜。给裸鼠肌注雌激素1 mg，3 d后，取细胞悬液0.1 mL，含细胞数0.5×107，分别接种于SFP Balb/c雌裸小鼠左侧腋窝乳腺皮下，3 d后再次种植1次，7 d后再次肌肉注射雌激素1 mg，种植后每天观察注射点有无破溃红肿，按规定时间测量肿瘤体积大小。

1.2.4 实验分组 以肿瘤直径达0.5 cm定为成瘤标准。将裸鼠随机分成4组，每组10只。分组方法：Ⅰ组：马齿苋MDA-MB-231组；Ⅱ组：马齿苋MCF-7组；Ⅲ组：MDA-MB-231组；Ⅳ组：MCF-7组。

1.3观察指标

1.3.1 肿瘤生长情况 自成瘤体之日起每3天分别以游标卡尺测量各组瘤体大小，按公式计算瘤体重量：瘤重=ab2/2 mg（a：长径，b：短径）计算瘤体重量和生长曲线；27 d后处死裸鼠，测瘤重，计算肿瘤生长抑制率：肿瘤生长抑制率=（1-处理组瘤重/空白对照组瘤重）×100%。

1.3.2 肿瘤的病理变化 12 d裸鼠体成瘤后，马齿苋MCF-7组和马齿苋MDA-MB-231组，每日给予配制的马齿苋生物碱溶液灌肠2次，每次15 mL，直至27 d治疗结束后2 h处死。将肿瘤标本称重后，常规福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，分别行HE染色观察病理变化。

1.3.3 高效液相色谱分析马齿苋生物碱组织亲和性 27 d后处死裸鼠，各实验组于处死裸鼠后，切除各组无坏死裸鼠恶性肿瘤组织各约1 g，并取瘤旁正常组织约1 g，4°C盐水中冲洗除掉血污，立即置入液氮中，低温冰箱存放。检测前分别取保存的标本少许，称重后，按100∶1的比例（质量/体积），低温条件下将标本超声粉碎并与生理盐水混合，制成10%的肿瘤组织及健康组织匀浆，高速离心后，取上清液待检。分别取各组标本组织上清液500 μL加入等体积的乙腈混合，混匀后室温下静置约20 min，然后高速离心约25 min，取5 μL上清液进样分析。严格按照色谱分析的操作程序进行，流动相有四种缓冲液：1号缓冲液为限制和终止液。2号缓冲液：柠檬酸三钠+苯酚+盐酸按规定比例混合溶解，加水稀释至2000 mL，调节pH=4.25，Millipore过滤器过滤并收集。3号缓冲液：柠檬酸三钠+氯化钠+盐酸+苯酚按规定比例混合溶解，加水稀释至2000 mL，pH=6.45，Millipore过滤器过滤收集。4号缓冲液：主要为氢氧化钠溶液，加水稀释至500 mL，配制成0.4 M浓度的溶液，Millipore过滤器过滤收集。采用梯度洗脱方式进行标本分析，初始相：A相为100%，B相为0；洗脱程序进行约8 min后，A相逐渐降至10%，B相又反向逐渐升高达到90%；随着时间的推移，A相和B相又逐渐回升至初始状态，泵流速为1.3 mL/min，荧光检测器的激发波长为335 nm，检测波长为455 nm，以外标法用紫外线检测器测定马齿苋生物碱的含量，面积外标法计算马齿苋生物碱的含量。

1.3.4 各实验组组织中VEGF表达水平 取各实验组肿瘤组织和瘤旁健康组织匀浆，利用ELISA法检测各组组织匀浆中VEGF表达水平。严格按照VEGF ELISA试剂盒操作说明进行。简述如下：分别将待检测的标本的组织匀浆加入检测板相应孔中（100 μL/孔），封孔室温孵育2 h。洗板数次并将板拍干，加入抗体工作液，封孔室温孵育1 h。洗板拍干，加入显色剂TMB避光室温孵育约20 min，加入终止液50 μL/孔，混匀后即可测量OD450值。根据检测的OD450值在标准曲线上查出其浓度。

1.4 统计学方法

实验数据采用SPSS 19.0统计学软件分析，计量资料不同组之间比较采用方差分析，组间比较采用t检验。对检测结果的相关性分析采用Spearson 积矩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荷瘤裸鼠腫瘤生长情况

接种肿瘤细胞后12 d左右，出现皮下肿瘤结节，待瘤达0.5 cm后为成瘤。自成瘤体之日起每3天分别以游标卡尺测量各组瘤体大小，观察27 d，杀鼠，肿瘤标本的称重结果及抑瘤率：Ⅰ组：（69.03±3.09）mg，95.03%；Ⅱ组：（69.10±4.12）mg，95.03%；Ⅲ组：（488.94±4.50）mg，0.37%；Ⅳ组：（489.96±6.27）mg，0.40%。可见，组间瘤重有显著差异（F=12727.420，P=0.000），第Ⅰ、Ⅱ组明显缩小，Ⅲ、Ⅳ组肿瘤生长情况组间无明显差异（P>0.166）。见封三图1。

2.2 肿瘤病理变化

见封三图2、3。封三图2为MDA-MB-231和MCF-7细胞组肿瘤组织切片，癌细胞呈实性条索状或小片状巢状生长，癌细胞多，间质较少，可见明显的核分裂。封三图3 为马齿苋MDA-MB-231组和马齿苋MCF-7组肿瘤组织切片，可见肿瘤细胞呈条索装生长，癌细胞数量减少，伴肿瘤细胞坏死和调亡，核分裂少见。

2.3 高效液相色谱分析肿瘤组织及正常对照组织的马齿苋生物碱水平

图1～5为高效液相色谱分析肿瘤组织及正常对照组织的波谱图，利用紫外线检测器测定各实验组马齿苋生物碱水平，以面积外标法计算马齿苋生物碱的含量。统计结果显示：两组试验结果显示肿瘤组织内的马齿苋生物碱含量高于肿瘤组织旁组织，有统计学差异（P=0.000）。肿瘤组织两组马齿苋生物碱含量无统计学差异（P=0.230）；肿瘤旁组织中马齿苋生物碱的含量无统计学差异（P=0.103）。见表1。

2.4 各实验组组织中VEGF水平变化

统计结果显示：MDA-MB-231组VEGF水平高于MCF-7组，有统计学差异（P=0.000）。肿瘤空白组（MDA-MB-231组和MCF-7组）VEGF含量高于马齿苋生物碱干预组（马齿苋MDA-MB-231组和马齿苋MCF-7组），有统计学差异（P=0.000）。马齿苋生物碱干预的两组VEGF含量无统计学差异（P=0.098）。见表2。

3 讨论

马齿苋为马齿苋科草本植物，分布广泛，不同气候条件均可生长，可食用亦可入药，药性寒味酸，既往研究发现马齿苋成分复杂，含皂甙、氨基酸、有机酸、生物碱、鞣酸类蛋白、维生素C以及抗肿瘤活性物质，具有清热、解毒、止痢、去湿抗肿瘤等功效[2-3]。其在祖国医学《本草经集注》和《本草图经》等经典中均有记载，具有很高的营养价值和药用价值。近年来研究发现马齿苋等有很多中药含有植物生物碱一类的活性物质，具有抗肿瘤、提高免疫力等多种生物学效应[4-10]，其生物学作用越来越受到研究者的重视，马齿苋生物碱属于植物生物碱的一类，目前马齿苋生物碱对乳腺恶性肿瘤抑制的作用和机制研究报道很少，本实验主要观察了马齿苋生物碱对人乳腺癌细胞增殖作用的影响，实验结果表明马齿苋生物碱对荷瘤裸鼠乳腺癌细胞增殖具有较好的抑制作用，抑瘤率高达95%。此前多项研究发现马齿苋多糖对肝癌细胞（SMMC7721）增殖具有明显的抑制作用[11-13]，与能使移植性实体瘤生长得到明显抑制的结论基本一致。马齿苋抗乳腺肿瘤的机制目前研究不多，机制也尚不十分清楚，分析其可能的机制是因为马齿苋生物碱激活了机体的体液免疫和细胞免疫功能，使T淋巴细胞的数量和活性增多、加强，并使细胞免疫也进入活跃状态，增强对肿瘤细胞的杀伤作用。卢新华等[14]研究发现马齿苋多糖可以显著提高小鼠巨噬细胞吞噬指数，促进淋巴细胞的转化，增强机体抗肿瘤活性。这也从一定意义上佐证了我们对马齿苋抗乳腺癌细胞机制的分析。

为了进一步研究马齿苋生物碱的抗肿瘤机制，本实验利用高效液相色谱分析了肿瘤组织和非肿瘤组织中马齿苋生物碱药物的聚集浓度，探索马齿苋生物碱肿瘤抑制的内在因素，研究结果显示乳腺癌组织对马齿苋生物碱有较高亲和性和相容性，乳腺癌组织马齿苋生物碱的亲和性明显高于肿瘤旁组织，且对肿瘤细胞的作用为持续性和渐进性，由此我们可以推测，肿瘤细胞膜上可能存在可供马齿苋生物碱结合的受体机构，通过竞争的结合，活化肿瘤细胞膜上某些静止状态和半静止状态的可结合马齿苋生物碱的受体。使其与游离状态的马齿苋生物碱结合，进而启动激活的肿瘤细胞调亡的信号通路，随着马齿苋生物碱浓度的增加和作用时间的延长，马齿苋生物碱在肿瘤部位高浓度聚集，可能对肿瘤细胞的杀伤或抑制作用逐渐增强。而在正常健康组织并不聚集，不会对正常组织产生损伤和毒性。研究结果显示在马齿苋生物碱干预后的乳腺癌细胞，无论是高迁徙专业特性的MDA-MB-231乳腺癌细胞，还是低迁徙转移特性的MCF-7乳腺癌细胞，均有较好的抗肿瘤和杀伤肿瘤的活性作用。病理切片显示在经过马齿苋生物碱治疗后，裸鼠肿瘤细胞数目减少，并伴有癌细胞的坏死和调亡，核分裂少。实验结果也证实了我们的推测。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血小板源性生长因子家族中的一个亚家族，在胚胎及后天的发育中，广泛参与血管的发生、血管的再生及淋巴管的生成。VEGF是恶性肿瘤独立的预后因子，在肿瘤的发生发展和转归中发挥着重要作用[15-16]，在人体多种组织的恶性肿瘤中均呈现高表达状态，VEGF表达水平主要与肿瘤组织微血管密度密切相关，呈正相关关系，高表达VEGF可以刺激组织细胞促使肿瘤血管生成，进而促进肿瘤发生发展，通过与细胞膜上VEGF受体特异性结合，激活细胞内信号通路的传导，介导络氨酸激酶磷酸化，从而使其发挥一系列生理功能[17-21]。本实验研究显示在体裸鼠乳腺癌组织中VEGF为高表达，水平含量较高，而经过马齿苋生物碱干预后VEGF水平显著降低，提示马齿苋生物碱可以干扰VEGF的代谢，进而抑制肿瘤的发生发展及转归。由此可以推测马齿苋生物碱具有成为抗人乳腺癌的一种新治疗药物，具有药物的开发潜力，同时也为乳腺癌的治疗寻找一种新的思路。

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（收稿日期：2016-12-10）