张强，翟西菊，魏丽，王新立，李新霞，姚迎迎

临床医学

非小细胞肺癌化疗药物耐药性及其与ERCC1、RRM1表达的相关性＊

张强，翟西菊，魏丽，王新立，李新霞，姚迎迎

目的探讨原代培养非小细胞肺癌（NSCLC）细胞对化疗药物的耐药性，及其与非小细胞肺癌组织中ERCC1、RRM1基因表达的关系。方法取手术切除的新鲜非小细胞肺癌组织标本，制备成活细胞浓度为（2～3）×105/ m l的单细胞悬液，分别加入10倍血浆峰值药物浓度顺铂（CDDP）、吉西他滨（GEM）、培美曲塞、依托泊苷（VP-16）。用MTT法检测经上述药物作用后肿瘤细胞活力及代谢活性的变化；同时取非小细胞肺癌组织制成石蜡切片，用免疫组化检测ERCC1、RRM1蛋白的表达。结果（1）ERCC1和RRM1在80例NSCLC组织中的表达均高于癌旁组织，差异有统计学意义（P值均<0.05）。（2）ERCC1的阳性表达与顺铂的耐药性有统计学意义（P<0.05）；RRM1的阳性表达与吉西他滨的耐药性有统计学意义（P<0.05）。结论ERCC1、RRM 1蛋白可能成为NSCLC患者化疗耐药的预测因子，二者联合检测有助于NSCLC患者个体化治疗方案的选择。

非小细胞肺癌；ERCC1；RRM 1；化疗耐药性；基因表达

肺癌是导致癌症患者死亡的重要原因之一，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）在我国约占肺癌总数的85%。手术切除及术后辅以放化疗是NSCLC的标准治疗方案，但治疗效果却欠佳，NSCLC患者的化疗有效率仅为30%～40%，生存时间提高有限［1-3］，患者中位生存期约为1年［4，5］。其最主要原因是肿瘤耐药及经验用药，所以基于化疗药物敏感性试验的个体化化疗成为治疗趋势。通过体外药敏试验，在化疗实施前筛选出有效的化疗药物，可以避免肿瘤耐药及经验用药等问题，对于实现肿瘤化疗的合理化、个体化有实用价值。

人切除修复交叉互补基因1（excision repair cross-complementing gene 1，ERCC1）定位于染色体19q13.2～19q13.3，是NER系统中的关键基因。ERCC1缺陷将会导致严重的DNA修复障碍［6］。RRM1是核苷酸还原酶（RR）调节M1亚单位。它能使二磷酸核苷酸转化为二磷酸脱氧核苷酸，后者是DNA合成和修复过程中必不可少的原料，因此，RR是DNA合成和修复的限速酶［7］。该文从临床实际出发，采用MTT比色法检测NSCLC一线化疗方案中常用的4种药物的敏感性，探讨NSCLC原代细胞对化疗药物的耐药性；用免疫组化法检测ERCC1、RRM1在NSCLC组织中的表达，并进一步分析其表达与化疗药物耐药性的相关性，为NSCLC的临床化疗提供个体化用药的实验资料和依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2012年1月—2015年12月在泰山医学院附属医院胸外科手术切除的，术后经病理证实的80例NSCLC标本。术前均未接受放化疗。其中男42例，女38例；年龄39～76岁，中位年龄54岁。

1.2 方法

1.2.1 MTT药物敏感试验［8］取外科手术切除的新鲜NSCLC组织80例。所取组织无坏死、变性，经酸性离子水反复冲洗后置于添加有100 IU/m l青霉素和100μg/m l链霉素的Hank的平衡盐溶液中。在超净工作台内，用无菌剪刀剪碎肿瘤组织，放入37℃含有链霉蛋白酶（XXV，Sigma Chemical，St. Louis，MO）、胶原酶（I，Sigma）和DNA裂解酶I（I，Sigma）的无菌液中轻轻搅拌消化20 min后，添加足够有效量的培养液。细胞通过尼龙网过滤，以1000 r/min离心10min，弃上清，用10%胎牛血清RPMI-1640培养液重悬。计数，调整活细胞浓度至（2～3）×105个/m l。试验组：取单细胞悬液加入96孔培养板，每孔100μl，分别加入药物终浓度为10倍血浆峰值浓度［9］的顺铂、吉西他滨、培美曲塞、VP-16，每组药物设5个复孔；置于37℃、5%CO2浓度的培养箱中培养24 h后，每孔加入0.5%MTT（5mg/ ml）20μl，4 h后终止培养。每孔加入0.04N盐酸异丙醇100μl，充分溶解所生成的结晶物，静止10min，通过酶标仪检测在570 nm波长光密度值（OD值）。取5复孔OD值的平均值作为肿瘤细胞在此药物组的平均OD值。）对照组每孔加入分离纯化后的单细胞悬液100μl，不加药物；空白组每孔加入100μl培养液；肿瘤细胞抑制率＝（对照组OD值－用药组平均OD值）/（对照孔平均OD值-空白组OD值）× 100%。肿瘤细胞抑制率≥30%为敏感，<30%为耐药。

1.2.2 免疫组化检测NSCLC组织及癌旁组织经10%中性福尔马林充分固定，常规石蜡包埋，免疫组化采用SP法，严格按试剂盒说明书进行。ERCC1主要在胞核和胞质中表达，RRM1主要在胞质中表达，阳性呈棕黄色颗粒。结果判定采用双盲法，运用Lecia Qwin Plus软件进行分析，定位准确的棕黄色颗粒面积>5%为阳性，<5%为阴性。

1.2.3 统计学方法采用SPSS 17.0统计包进行分析，计数资料用χ2检验，连续性校正χ2检验和Fisher精确概率计算法进行显著性检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化染色结果ERCC1主要定位于细胞核和细胞质，RRM1定位于细胞质呈棕黄色颗粒。见图1～4。ERCC1和RRM1在80例NSCLC组织中的表达均高于癌旁组织（42 vs 22，40 vs 21），差异具有统计学意义（P值均为0.000）。

图1 ERCC1在NSCLC中细胞核阳性表达（SP法×200）

图2 ERCC1在癌旁组织中细胞核阳性表达（SP法×200）

图3 RRM 1在NSCLC中细胞质阳性表达（SP法×200）

图4 RRM 1在癌旁组织中细胞质阳性表达（SP法×200）

2.2 NSCLC组织中ERCC1、RRM 1与表达结果与M TT药敏的关系将MTT检测结果中抑制率≥30%者判为敏感，而<30%者判为耐药。ERCC1的阳性表达与顺铂的体外耐药性有统计学意义（P＝0.010，P<0.05）；与吉西他滨、培美曲塞及VP-16与的体外耐药性无关（P>0.05）；RRM1的阳性表达与吉西他滨的体外耐药性有统计学意义（P＝0.010，P< 0.05；与顺铂、培美曲塞及VP-16与的体外耐药性无关（P>0.05）。见表1。

3 讨论

在世界范围内，肺癌是死亡率最高的疾病之一。晚期非小细胞肺癌患者的一线化疗方案是铂类联合三代新药如紫杉类、吉西他滨、培美曲塞、长春新碱、伊立替康等［10，11］。然而，晚期非小细胞肺癌患者的5年生存率仍低于15%。研究表明非小细胞肺癌患者治疗效果不理想的原因之一是肿瘤细胞对于化疗药物的耐药性。

表1 NSCLC组织中ERCC1、RRM 1与表达结果与MTT药敏的关系

ERCC1定位于19号染色体上，是核苷酸剪切修复家族中的重要成员之一，是核苷酸切除修复系统（NER）的关键酶，其与XPF形成异源二聚体，在受损DNA单链的5’端进行剪切而发挥功能。铂类化疗药物的作用机制是：铂类作为一种重金属复合物与肿瘤细胞的DNA双链形成加合物导致DNA损伤，进而引起肿瘤细胞死亡，从而起到抗肿瘤作用。当ERCC1在肿瘤组织中过表达并激活NER通路后，使停滞在G2/M期细胞的损伤DNA得到迅速修复，从而导致肿瘤对铂类药物产生耐药性［12，13］。笔者分析了80例非小细胞肺癌患者肿瘤细胞和癌旁组织中ERCC1表达，研究表明ERCC1的阳性表达与顺铂的耐药性有统计学意义（P<0.05），体外试验的结果显示ERCC1的阳性表达与顺铂的体外耐药性有统计学意义（P＝0.010），与Cho等的研究是一致的［12］。

RRM1是核苷酸还原酶调节M1亚单位，是DNA合成与修复通路中的限速酶，也是核苷类似物系化疗药物吉西他滨的结合位点，后者通过抑制核苷酸还原酶的活性起到杀伤肿瘤细胞的作用。Rosell等［1］采用定量PCR方法检测了75例NSCLC组织标本中RRM1 mRNA表达，在接受了吉西他滨/顺铂联合化疗组发现RRM1 mRNA低表达的患者对化疗的反应较好，患者从治疗开始至肿瘤病灶出现进展的时间与RRM1 mRNA的表达水平呈负相关。Ceppi等［14，15］研究表明NSCLC组织中RRM1高表达的患者对吉西他滨耐药。其作用机制可能是RRM1过表达逆转二磷酸核苷酸成为二磷酸脱氧核苷酸，促进核苷类似物系化疗药物引起的DNA损伤修复，从而产生耐药。该研究显示RRM1的阳性表达与吉西他滨的体外耐药性有统计学意义（P＝0.010）；与顺铂、培美曲塞及VP-16与的体外耐药性无关（P>0.05），与上述结论一致。

最近国内外许多研究表明，药敏试验可以作为研究肿瘤化疗疗效的有效方法，肿瘤细胞的体外化疗药物敏感性试验结果与体内化疗疗效的符合率达80%以上，且试验结果为阴性者，几乎可以肯定为体内临床用药的耐药病例［9，16］。因此，通过体外MTT药敏试验对NSCLC不同个体进行化疗药物筛选是克服NSCLC耐药性和提高患者生存率的有效途径之一。

综上所述，ERCC1、RRM1的表达水平可预测NSCLC患者的化疗药物耐药性，在化疗前联合检测ERCC1、RRM1可为NSCLC的临床化疗提供个体化用药的方案和依据。

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［2016－07－08收稿，2016－08－06修回］［本文编辑：董冰媛］

Drug-resistance of NSCLC to chemotherapy，and its relativity w ith ERCC 1 and RRM 1 expression

ZHANG Qiang①，ZHAI Xi-jü，WEI Li，et al.
①The Affiliated Hospital to Taishan Medical College，Tai'an，Shandong 271000，China

Objective To evaluate the drug-resistance of NSCLC to chemotherapy and to explore the relationship between ERCC1 or RRM1 expression and the resistance.M ethods NSCLC fresh specimens from surgically resected tisssues were sampled.A single-cell suspension of tumor cells（2×105to 3×105cells/m l）were separately exposed to cisp latin（CDDP），gemcitabine（GEM），pemetrexed，Etoposide（VP-16）at ten times peak plasm concentration（PPC）.Inhibitory rate of cells was detected by MTT assay.Expression of ERCC1 and RRM1 in NSCLC tissues were detected by immunohistochemistry（IHC）.Results 1）The positivity of ERCC1 and RRM1 was significantly hyper-expressed in NSCLC compared with control adjacent tissue（P<0.05）.2）The positive expression of ERCC1 stained cells showed resistance to cisplatin（P<0.05）；The positive expression of RRM1 stained cells showed resistance to GEM（P<0.05）.Conclusion ERCC1，RRM1 protein may be taken as predictors of the NSCLC patients with drug-resistance to the chemotherapy，the joint detection helps NSCLC patients to choice individualized treatment plan.

NSCLC（non-small cell lung cancer）；ERCC1；RRM1；Drug-resistance to chemotherapy；Gene expression

R734.2

A

10.14172/j.issn1671-4008.2017.01.004

山东省医药卫生科技发展计划项目（2013WS0322）

271000山东泰安，泰山医学院附属医院（张强，魏丽，王新立，李新霞，姚迎迎）；泰安市肿瘤医院（翟西菊）