林 蓁

FR显色剂在含色素组织免疫组化染色中的应用

林 蓁

色素； FR显色剂；免疫组织化学

免疫组化染色技术在现代病理诊断工作中起着十分重要的作用。了解常规HE染色无法区分或较难辨别的情况，为病理肿瘤的鉴别诊断、预后判断提供不可或缺的重要依据。但在一些病理组织标本中含有与免疫组化阳性颗粒相近的色素，如黑色素。这些色素沉积若大量存在会不同程度遮盖组织细胞的结构与形态。特别是免疫组化染色时会与DAB显色的阳性颗粒相互干扰，难以区分。对免疫组化结果判读造成一定的影响。这就需要有一些办法来解决。传统的方法存在不少限制。根据病理诊断的需要及染色技术的许可性，我科对含有较多色素的组织运用罗氏免疫组化ultra View Universal AP Red Detection Kit(AP染色液)来标记。FR显色，阳性颗粒为玫红色，定位准确、清晰可辨，与组织原含色素颗粒颜色对比鲜明。标记效果佳，能较好解决上述问题，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料 收集厦门大学附属成功医院病理科2015年间存档的含有色素组织标本20例。

1.2 方法

1.2.1 组织处理与分组 标本均经10%中性缓冲福尔马林固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明，石蜡浸泡后包埋制成蜡块。将蜡块3 μm厚切片，裱在防脱载玻片上，每个蜡块切3张切片，65 ℃ 30 min烤片待用。每个蜡块3张切片均分3组，第一组HE染色，第二组免疫组化标记DAB显色，第三组免疫组化标记FR显色。

1.2.2 免疫组化 使用罗氏BenchMark XT免疫组化全自动染色仪，一组采用ultra View Universal DAB Detection Kit，DAB染色液(主要试剂包含：3%过氧化氢液，通用HRP多聚体，DAB显色剂，5 g/L硫酸铜液)；另一组采用ultra View Universal AP Red Detection Kit，AP染色液(主要试剂包含：通用AP多聚体，快红A、快红B显色剂，11%氯化镁液)。上述染色试剂盒均购自罗氏诊断产品(上海)公司；一抗包括Melan-A、HMB-45、CKpan、Ki-67均购至福州迈新公司。根据预先优化好的程序，打印并贴好条形码上机操作。染色程序结束后，少许稀释洗洁精去除油膜，清水将切片清洗干净。DAB显色切片用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。FR显色切片不可使用乙醇类脱水剂脱水。用水性封片剂封固，也可用电吹风微风吹干或自然晾干，中性树胶封固。

1.2.3 结果判断 CKpan阳性颗粒定位于胞质、Ki-67阳性颗粒定位于胞核、Melan-A阳性颗粒定位于胞质、HMB-45阳性颗粒定位于胞质。第1组：HE染色，可见切片较多原含色素颗粒。第2组：免疫组化染色，采用DAB显色，阳性颗粒显示棕褐色。第3组：免疫组化染色，采用FR显色，阳性颗粒显示玫红色。

2 结果

第1组：HE染色可见组织切片中原含色素量较多(图1)，可作对照。第2组：采用ultra View Universal DAB Detection Kit染色系统(DAB染色液)，可见DAB显色阳性颗粒为棕色，与组织中原含色素颜色接近，不易辨认(图2)。第3组采用ultra View Universal AP Red Detection Kit(AP染色液)，FR显色阳性颗粒为鲜艳的玫红色，定位准确，背景清晰(图3)，与标本中原所含的色素(黑色、褐色、棕色等)形成鲜明对比，很容易做出分辨，大大提高免疫组化阳性判读准确率。

图1 皮肤组织切片：HE染色可见较多明显的黑色素颗粒图2 皮肤组织切片：免疫组化标记Melan⁃A，DAB显色阳性颗粒棕褐色与组织原有的色素颗粒颜色接近，较难辨认，ultraViewUniversalDABDetectionKit染色 图3 皮肤组织切片：免疫组化标记Melan⁃A，FR(A+B)显色阳性颗粒玫红色，表达清晰。与组织原有的色素颗粒棕褐色，对比分明，辨识度高，利于判读，ultra View Universal AP Red Detection Kit染色系统染色

3 讨论

许多色素在常规HE切片上看上去相似而不易区分，通常需要采用各种特殊染色方法以确定色素性质[1]。常见含铁血黄素、黑色素或其他色素(脂褐素、胆色素、甲醛色素、碳颗粒等)。色素含量较多时，常覆盖在组织细胞上，遮盖了组织细胞的结构与形态，特别在免疫组化标记判读时造成一定的干扰。

传统的一些方法中，较具代表性的是对含有黑色素的组织切片进行祛黑色素，再进行免疫组化染色。黑色素十分稳定，完全不溶于水及有机溶剂，但长时间在强碱中则可被溶解，其可被强氧化剂如过氧化氢和高锰酸钾等脱色质[2]。最常用的祛黑色素法是使用强氧化剂，如高锰酸钾脱去黑色素，再用草酸褪去高锰酸钾的颜色；郭以河等[3]报道改良方法。祛黑色素方法较费时，不易掌握使用程度。使用强氧化剂处理后的组织玻片，防脱片作用减弱许多，该方法最终的效果不佳，组织切片在免疫组化抗原修复及后续的过程中有不同程度的脱片现象。

在一定耐受空间内，组织抗原不会过多丢失，只是估计抗原丢失的可能，对其丢失程度无法量化。强氧化剂的过度处理对组织切片中的抗原、抗体均会产生一定程度影响，在免疫组化标记中较难得到满意的效果。另外，组织所含色素颗粒种类较多，如遇到肺碳颗粒沉着色素，即使强氧化剂高锰酸钾也无法褪去，也不易用其他方法处理褪去，这就需要有其他的方法来解决问题。

本文使用罗氏BenchMark XT全自动免疫组化染色仪，采用AP染色液，通过沉积红色有色沉淀物使特异性抗原的位点显色，有效避免了组织切片中原含色素的干扰，阳性颗粒表达为玫红色，重现性强，结果稳定。光镜观察，切片常温可长期保存。根据需要选择抗体，阳性颗粒显示的色彩与标本组织中所含色素(黑色、褐色、棕色等)对比鲜明，不会互相干扰。结果观察表明，DAB染色液换成AP染色液，FR显色较DAB显色结果，更能区别组织中原有的色素颗粒。方法无需进行复杂的祛黑色素步骤，也避免了抗原、抗体丢失或减弱等顾虑，免疫组化染色步骤及时间并未增加，免疫组化染色效果明显更佳。

需要注意的是，FR显色后组织切片需用水洗，接触乙醇类脱水剂可使标记的红色阳性颗粒褪去，令实验失败。可参考ultra View Universal DAB Detection Kit的修复、孵育时间等，且必须设置阴性、阳性对照，优化好的程序可用在ultra View Universal AP Red Detection Kit。免疫组化标记的判读，在光镜下观察，先确定阴性、阳性对照表达清晰易辨，定位正确，才可对检测的组织切片进行判读。对原含色素的组织，参考HE切片了解组织原含色素颗粒的定位及强弱，确定标记抗体阳性定位，客观地对表达结果的正确性进行分析。对定位或显色不正确的应重新进行染色。有时候细胞中堆积过量色素，会妨碍抗体与细胞中抗原的结合，造成假阴性或染色减弱，就是更换成FR显色剂也解决不了这个问题时，脱色素具有必要性。

在病理工作中还会遇见其他色素，如肺碳颗粒沉着(黑色)、含铁血黄素(黄棕色)等。近年来，我们在工作实践中不断的探索和尝试，上述方法也可推广应用到其它色素免疫组化染色中。正确规范化操作，注意质量控制，尽可能使实验条件最优化，得到满意结果。将优化程序相对固定下来，并在以后的染色中观察变化，并不断完善，细致的工作才能得到较满意的实验结果。

[1] 来茂德. 病理高级教程[M]. 北京: 人民军医出版社, 2013:691.

[2] 梁英杰, 凌启波, 张 威. 临床病理学技术[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2011:161-162.

[3] 郭以河, 张闽峰, 孟家榕, 等. 快速祛除组织中黑色素的改良方法[J]. 临床与实验病理学杂志, 2011,27(2):214.

时间：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1015.058.html

厦门大学附属成功医院病理科，厦门 361003

林 蓁，女，副主任技师。E-mail: xmlinzhen@139.com

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1001-7399(2017)02-0217-02

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.026

接受日期：2016-09-21