乔 梁，周 盛，杨 军，滕华建，蒋 青

石蜡包埋软骨组织中DNA提取方法的改良

乔 梁1，周 盛1，杨 军2，滕华建3，蒋 青1

软骨；石蜡包埋；DNA

随着基因遗传学的发展，DNA检测技术也日臻完善，而对某些特定疾病的基因分析能为探究疾病的发病机制以及遗传概况提供可靠的方法学依据。各大医院的病理科均存留着大量的组织蜡块，从这些石蜡标本中提取DNA可以在短时间内获得足够的目标疾病DNA。目前已有多位学者对从石蜡包埋样本中提取DNA的方法学进行了大量的探索和研究[1]，对于不同组织，提取DNA的难易程度会有很大不同：从细胞数量比较多的肺组织和肠组织中提取DNA已易做到，但对于软骨组织，这一类密度很低而且细胞数目很少的组织中提取DNA仍存在一定困难。针对这一问题本文现探究从石蜡软骨组织切片中提取DNA并用于基因检测的方法。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2012年～2015年南京大学医学院附属鼓楼医院存档的软骨瘤和软骨肉瘤福尔马林固定后的石蜡组织包埋块。软骨瘤34例，其中男性18例，女性16例，年龄14～72岁，平均43.7岁。软骨肉瘤31例，其中男性17例，女性14例，年龄22～79岁，平均44.0岁。所有患者均经经验丰富的病理医师明确诊断。标本来自股骨、胫骨、肋骨、骨盆等全身各处软骨组织。

1.2 方法 对于每块蜡块均先切除表面两层已污染和氧化的部分[2]，然后切取一张2 μm厚切片用于HE染色，最后根据标本的大小切取3～6张10 μm厚切片用于DNA提取。为了精确提取软骨及软骨肿瘤的组织，所有样本的HE切片均经经验丰富的病理医师镜下画出软骨及软骨肿瘤部分，根据HE切片的画取部分，选择性地刮取切片样本用于提取DNA。

1.3 DNA提取方法和试剂 参考袁亚婷等[3-6]总结的方法，选择改良TES水浴脱蜡-酚氯仿法作为传统的提取方法。该方法对肺组织和肠组织均能很好地提取出DNA，然而对于软骨组织的DNA提取效果不佳，所提出的平均浓度仅有12 ng/μL。浓度太低难以达到后续的PCR及测序的要求。

本实验采用Qiagen公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit试剂盒提取法。方法如下：(1)将固定在载玻片上的切片标本分别浸入二甲苯缸脱蜡20 min，浸入乙醇缸洗二甲苯15 min。(2)将标本刮入EP管内，加入180 μL Buffer ATL和20 μL蛋白酶K，在56 ℃和90 ℃先后孵化1 h。(3)加入200 mL buffer AL和200 mL乙醇，震荡混匀。(4)将全部的溶液转移至纯化柱内，8 000 r/min离心1 min，丢弃滤液。加入500 mL Buffer AW1，8 000 r/min离心1 min，丢弃滤液。加入500 mL Buffer AW2，8 000 r/min离心1 min，再次丢弃滤液。再次离心，甩干所有液体。(5)把纯化柱放入新的EP管内，加入50 μL Buffer ATE。14 000 r/min离心1 min所得即为DNA。

本实验采用此试剂盒所提取的DNA浓度远远高于一些传统方法提取的浓度，且提取时间也大为缩短。但由于一些组织存放时间太久或者细胞含量太少所提取浓度也偏低，为了提高提取浓度，本文总结了两种对试剂盒提取改良方法。方法一：在实验开始的时候对于同一样本做2份，最后在步骤(4)加入纯化柱时把2份同一样本的滤液合在一个纯化柱里离心，可以达到提高浓度的效果。方法二：直接将石蜡样本切蜡卷放在EP管里，脱蜡再提取DNA。即更改步骤(1)为：加入1 mL二甲苯在装有样本的EP管内，盖上盖子充分震荡10 s，14 000 r/min离心2 min，弃上清。加入1 mL乙醇(96%～100%)，充分震荡10 s，14 000 r/min离心2 min，弃上清。打开EP管盖，室温下静置10 min至乙醇完全挥发。

2 结果

2.1 提取结果 1例软骨瘤样本因经过脱钙处理后DNA浓度太低无法进行下一步实验，剩余33例软骨瘤样本DNA平均OD260/280=1.848，平均浓度为64.504 ng/μL(图1)。31例软骨肉瘤样本DNA平均OD260/280=1.868，平均浓度为63.644 ng/μL(图2)。本实验发现DNA提取的浓度结果受软骨石蜡标本的保存时间、标本组织的大小以及软骨细胞的影响。

图1 软骨瘤DNA提取结果分布左下角DNA极低的个例即是脱钙处理的样本

图2 软骨肉瘤DNA提取结果分布

2.2 PCR测序结果 本次提取的DNA主要用来检测LKB1基因在这些软骨瘤及软骨肉瘤样本中是否有突变[7-8]。64例样本均完成基因检测，但未检测出任何突变结果(图3)。

图3 软骨组织石蜡标本提取DNA的测序图截取部分

12例样本选用常规试剂盒法提取，平均浓度为35.325 ng/μL，其中8例样本由于浓度过低无法后续实验，再次换用改良的提取方法。对于标本体积较大而肿瘤组织部分较少者选择改良方法一，刮取2份样本，最后再放在同一纯化柱里离心，共27例，平均浓度82.435 ng/μL。对于样本体积较小而肿瘤组织比例较大者选择改良方法二，直接切成蜡卷放入EP管里进行脱蜡提取，共33例，平均浓度为66.815 ng/μL。从浓度上看改良方法一的提取浓度高于改良方法二，但由于两种方法所选择的样本不同，所以并不能认为改良方法一优于改良方法二。

3 讨论

每个医院的病理科均存有大量的石蜡标本，对于基因遗传学的研究来说这些标本均是极其容易获取的巨大财富。因此能够熟练成功地从石蜡标本中提取DNA并用于基因检测对基因遗传学的研究十分重要。

但是由于组织的特异性，不同组织的石蜡标本提取DNA的难易程度也有很大不同。从肠或肺组织中提取DNA可以很容易获取高浓度的DNA。但是对于骨和软骨这样的组织成分比较多，细胞成分却很少的特殊组织，从石蜡包埋的样本中提取DNA存在着一定难度。有学者总结了从骨组织中提取DNA的方法[9-11]。对于软骨组织，采用蛋白酶K-Chelex100法用于大块软骨组织提取的DNA能得到比较满意的结果[12-13]，但是用于石蜡包埋软骨组织中提取DNA难度却很大。对于新鲜且组织量较大的石蜡包埋软骨组织，采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit试剂盒能获取较好的DNA。

对于试剂盒常规使用仍不能够提取足够浓度DNA的情况，作者总结了两种改良方法。方法一：由于试剂与EP管容积的限制，每次使用样本数量有限制，为了提高产量，实验在开始的时候对于同一样本做2份，即同一标本选择6～12张切片，平均分在2个EP管内，同时进行前3个步骤。在步骤(4)加入纯化柱时再合在一个纯化柱里可以达到提高浓度的效果。方法二：直接切3～6张蜡卷放在EP管里脱蜡再提取，这样既可增加软骨组织的量又能避免脱蜡引起的损失。该方法也能较好地提高提取DNA的浓度，缺点是无法对照HE切片精确选择软骨部分。

不过该试剂盒及改良方法对于脱钙的软骨样本提取仍存在着很大的困难，常用的脱钙方法主要是强酸脱钙和EDTA脱钙两种。强酸脱钙效率高但是会严重破坏DNA的结构，导致DNA提取结果浓度很低而且碎片化很严重，很难用于下一步的PCR和基因测序。EDTA脱钙一般不会破坏组织的DNA，但是缺点是耗时太长。而病理科为了提高效率基本使用强酸脱钙，所以病理科脱钙的样本往往不能挑选使用。

本实验第一次探讨了能否从石蜡包埋的软骨组织中提取DNA进行基因检测以及如何提高DNA的提取浓度。本实验除1例脱钙标本由于提取浓度过低DNA片段太小以外，其余的64例样本均成功提取了DNA并顺利地进行了PCR和基因测序。该方法可以为软骨肿瘤相关基因学研究，快速提取到大量的DNA进行基因检测提供一些指导意义。

[1] 张玲玲, 刘月平, 王永军, 王小玲. 石蜡包埋组织基因组DNA提取的条件优化[J]. 临床与实验病理学杂志, 2011,27(9):1021-1023.

[2] Sikora M J, Thibert J N, Salter J,etal. High-efficiency genotype analysis from formalin-fixed, paraffin-embedded tumor tissues[J]. Pharmacogenomics J, 2011,11(5):348-358.

[3] 高 晗, 韩德民, 黄志刚. 从福尔马林固定石蜡包埋的切片中提取DNA的方法改进[C]. 南京: 中华医学会第十次全国耳鼻咽喉-头颈外科学术会议, 2007:360-361.

[4] 张素娟, 赵 彤, 董敬朋. 石蜡切片DNA提取方法的改良及其临床应用[J]. 临床与实验病理学杂志, 1996,12(4):363-364.

[5] 袁亚婷, 江岳鑫, 尹小文, 等. 四种石蜡包埋组织DNA提取方法的比较[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2010,14(24):4430-4434.

[6] 盖宝东, 房学东, 金仲田, 等. 提高石蜡包埋组织中提取DNA质量的实验研究[J]. 吉林大学学报(医学版), 2003,29(1):115-118.

[7] Ananian V, Tozzo P, Ponzano E,etal. Tumoural specimens for forensic purposes: comparison of genetic alterations in frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissues[J]. Int J Legal Med, 2011,125(3):327-332.

[8] Ghatak S, Saanga Z, Pautu J L,etal. Coextraction and PCR based analysis of nucleic acids from formalin-fixed paraffin-embedded specimens[J]. J Clin Lab Anal, 2015,29(6):485-492.

[9] 陈国弟, 辛军平, 廖志刚, 等. 人骨及福尔马林浸泡组织中DNA的提取[C]. 重庆:第二次全国法医物证学学术交流会, 1998:196-198.

[10] 张青军, 景 强. 石蜡包埋骨组织的DNA检验[J]. 法医学杂志, 2013,29(2):145.

[11] 李荣华, 张 林, 吴梅筠, 等. 一种改良的骨组织DNA提取方法[J]. 法律与医学杂志, 2000,7(3):131.

[12] 王会品, 王孝力, 杨 巍, 等. 蛋白酶K-Chelex100法提取肋软骨DNA技术的优化[J]. 中国法医学杂志, 2012,27(1):54-55.

[13] 向超杰, 李 安, 余建华, 等. 用Chelex-100方法提取肋软骨DNA 105例 [J]. 昆明医学院学报, 2007,28(2B):64-66.

时间：2017-2-27 10:14

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170227.1015.056.html

国家自然科学基金(81420108021)

1南京大学医学院附属鼓楼医院运动医学与成人重建外科、2病理科，南京 2100083南京大学模式动物研究所骨与关节疾病遗传研究实验室，南京 210061

乔 梁，男，硕士研究生，医师。Tel: (025)83106666-61031，E-mail: smartmedq@163.com 蒋 青，男，博士，主任医师，通讯作者。E-mail: jiangqing112@hotmail.com

R-331

B

1001-7399(2017)02-0215-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.025

接受日期：2016-09-18