刘卫华++++++邓红琴

[摘要] 目的 探讨外源性硫化氢对大鼠睾丸缺血再灌注损伤的保护作用。 方法 选取成年雄性Wistar大鼠30只随机分为3组，每组各10只：对照组（A组）、睾丸缺血再灌注损伤组（B组）、睾丸缺血再灌注损伤+硫化氢干预组（C组）。B组和C组大鼠建立睾丸扭转复位模型，C组在再灌注前腹腔注射外源性硫化氢（100 μmol/kg）。HE染色观察睾丸组织病理改变；测定丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）含量；采用原位缺口末端标记检测细胞凋亡指数；免疫组化检测睾丸组织中的Bax，Bcl-2和Caspase-3的表达情况。 结果 B组可见生精上皮排列紊乱，生精细胞广泛脱落。与A组比较，B组中MDA含量和生精细胞凋亡指数明显升高，SOD活性明显下降，差异有统计学意义（P < 0.05），B组中Bax/Bcl-2比值及Caspase-3表达明显高于A组；C组明显改善睾丸缺血再灌注损伤引起的变化，C组中MDA含量、SOD活性、生精细胞凋亡指数与B组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 外源性硫化氢可减轻氧化应激水平和抑制生精细胞凋亡， 从而在睾丸组织在缺血再灌注损伤过程中发挥保护作用。 [关键词] 硫化氢；睾丸；缺血再灌注损伤；氧化應激；凋亡

[中图分类号] R563 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（b）-0025-04

[Abstract] Objective To investigate the protective effects of hydrogen sulfide （H2S） on the testicular ischemia-reperfusion injury in rats. Methods Thirty adult male Wistar rats were randomly divided into 3 groups， with 10 rats in each group， control group （group A）， testicular ischemia-reperfusion injury group （group B）， testicular ischemia reperfusion injury + H2S intervention group （group C）. The rats of group B and C underwent testicular torsion lasting 2 hours， H2S （100 μmol/kg） was injected intraperitoneally before reperfusion in group C. HE staining was used to observe the pathological changes of testis； Malondialdehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD） content were determined； cell apoptosis index was detected by dUTP nick end labeling； the expression of Bax， Bcl-2 and Caspase-3 in testis tissue were detected by immunohistochemistry. Results After ischemia-reperfusion injury， the left testicular tissue showed desquamation of epithelial cells in the lumen， disordered arrangement of spermatogenic cells. Compared with the group A， MDA content and the spermatogenic cell apoptosis index were significantly increased， and SOD activity significantly decreased in group B， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The expression of Bax/Bcl-2 ratio and Caspase-3 in group B were significantly higher than those in group A； the group C obviously improved the changes of testicular IRI， MDA content， SOD activity， the apoptosis index in group C were compared with group B， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion H2S reduces the level of oxidative stress and inhibits the apoptosis of spermatogenic cells， it plays a protective role in the process of ischemia-reperfusion injury.

[Key words] Hydrogen sulfide； Testis； Ischemia-reperfusion injury； Oxidative stress； Apoptosis

睾丸扭转是泌尿外科中常见的急症之一，多发生于新生儿和青少年时期[1]。一旦确诊，应尽早采取手法复位和手术治疗方式恢复睾丸血流[2]。睾丸扭转复位是一种典型的缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）过程[3]。硫化氢（H2S）作为一种新型的气体信号分子，在多种器官的缺血再灌注损伤过程中，具有抗氧化、抗炎及抗凋亡等作用[4]。但是H2S对睾丸IRI的影响少见于报道，本研究通过建立大鼠睾丸IRI模型，观察外源性H2S在大鼠睾丸IRI过程中的作用，为睾丸IRI的防治提供新的手段。

1 材料与方法

1.1 试剂及器材

NaHS（H2S外源性供体）（Sigma公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；原位细胞凋亡检测试剂盒（德国罗氏生物技术有限公司）；Caspase-3，Bax、Bcl-2抗体（加拿大圣克鲁斯公司）；免疫组化检测试剂盒（福建迈新公司）。

1.2 实验动物和分组

30只成年雄性Wistar大鼠，年龄约10周，体重250～300 g，购于湖北省疾病预防与控制中心。随机分为3组，每组各10只。实验前，所有大鼠饲养在恒定温度的房间（22±2）℃，给予相同的食物和水。所有大鼠经腹腔注射2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉。对照组（A组）：左侧睾丸行阴囊切口后缝合切口，不给予任何干预措施，8 h后麻醉取材；睾丸IRI组（B组）：左侧阴囊切口，720°顺时针扭转睾丸，5-0丝线固定于阴囊皮肤，扭转2 h后睾丸恢复自然位置，再灌注6 h后麻醉取材；睾丸IRI+H2S干预组（C组）：在B组基础上，再灌注前腹腔注射外源性H2S（100 μmol/kg ），再灌注6 h后麻醉取材。

1.3 取材及標本制备

再灌注后6 h，快速脱颈椎法处死所有大鼠，快速采集左侧睾丸标本。仔细剪除附着的脂肪组织和筋膜，生理盐水冲洗后以滤纸拭干用于随后的实验。

1.4 HE染色

在相对无菌的条件下，用生理盐水将睾丸组织冲洗干净后，置于4%的甲醛溶液中固定24 h，然后行石蜡包埋。5 μm厚切片，脱蜡，水化后并进行HE染色，光镜下观察睾丸组织的形态学改变。

1.5 MDA和SOD测定

MDA和SOD是氧化应激的指标。冷冻的睾丸组织匀浆、离心（3000 r/min，10 min），然后收集上清液。MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定，SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法，操作按照说明书指示进行。于吸光度在532 nm处测定MDA水平，单位为 nmol/g蛋白。在吸光度550 nm处检测SOD活性，单位为U/mg蛋白。

1.6 生精细胞凋亡检测

生精细胞凋亡检测采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法，细胞核染成棕色者为TUNEL阳性细胞，光镜下（200×）每张切片选取10个视野，计数500个细胞。生精细胞的凋亡指数（AI）= 阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.7 免疫组化

Bax，Bcl-2和Caspase-3的表达采用免疫组化染色分析，所有的步骤按说明书指示进行，显微镜下棕褐色为阳性染色。采用Image-Pro Plus 6.0进行免疫组化的图片分析，每张切片随机选定5个视野，设定基线标准染色强度的判定标准后，测定5个视野下的平均光密度值，其值越大，染色越深，反映细胞内蛋白表达量越高。

1.8 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。2 结果

2.1 睾丸组织的病理学改变

A组可见曲精小管内各级生精细胞排列有序，管腔有大量精子，未见明显损伤；B组可见生精上皮排列稀疏、紊乱，间质水肿，生精细胞广泛脱落；C组可见生精细胞排列正常或轻度紊乱，少数腔内可见脱落的生精细胞（图1，封四）。

2.2 睾丸组织中MDA、SOD含量的变化

B组中MDA含量明显高于A组（P < 0.05）；经H2S处理后，C组中MDA含量较B组显著降低（P < 0.05）。B组SOD活性明显低于A组（P < 0.05）； H2S干预后，C组睾丸SOD活性明显较B组增高（P < 0.05）。见表1。

2.3 睾丸组织生精细胞凋亡情况

A组可见较少的、散在的生精细胞凋亡；B组中生精凋亡细胞较A组显著增加，染色阳性细胞主要分布在各级生精细胞，与A组比较差异有统计学意义（P < 0.05）；C组生精细胞凋亡较B组明显减少，差异有统计学意义（P < 0.05）。见图2（封四）、表2。

2.4 睾丸组织中Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达情况

免疫组化染色检测睾丸组织Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达，结果显示Bax、Caspase-3在A组仅可见生精细胞细胞质和细胞核中散在的阳性表达；B组中，其阳性表达较A组明显增多，表现为细胞质和细胞核呈现为黄色或棕黄色；与B组比较，C组中阳性表达明显减少。Bcl-2在A组中可见生精细胞细胞质中大量表达；B组和C组中阳性表达较A组明显减少。见图3（封四）。

3 讨论

睾丸扭转复位是IRI主要的病理生理过程，可引起睾丸结构功能的改变、氧化应激水平升高以及生精细胞的异常凋亡[5-7]。H2S是继内源性一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的第三种气体信号分子，其无色，有臭鸡蛋气味，可溶于水及脂溶性溶剂，在体内以H2S/NaHS的形式保持动态平衡[8]。研究显示，H2S在多种器官的缺血再灌注损伤过程中发挥作用[8]。Yong等[9]发现一定浓度的外源性H2S可明显降低IRI后心肌梗死面积，对大鼠心肌产生保护作用；Hosgood等[10]使用无心跳供体的猪肾移植模型观察外源性H2S对肾缺血再灌注损伤的作用发现，使用H2S可明显降低血肌酐并能改善再灌注后肌酐清除率。Kimura等[11]报道了H2S可明显减少氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的生成，从而抑制大鼠神经细胞线粒体中的氧化应激水平；本实验采用HE染色观察睾丸IRI对大鼠睾丸组织学变化的影响，结果显示：IRI组出现生精上皮排列紊乱，生精细胞广泛脱落等表现，严重影响了睾丸结构及生精功能；外源性H2S治疗后明显改善了睾丸缺血再灌注引起的组织学损伤。

氧化應激是ROS过量产生或细胞内抗氧化机制障碍导致的活性氧自由基大量积累的结果。过量的活性氧可以氧化细胞膜蛋白、脂质和DNA，导致一系列细胞功能障碍或死亡[12-13]。IRI过程中伴有氧自由基的产生，而后者促进了IRI的进一步发展。MDA是脂质过氧化分解产生最终产物，通常可作为氧化应激水平的标志物。SOD是细胞生长、分化过程中的重要组成部分[14]， 其抗氧化能力可改善睾丸IRI的损伤[15-16]。在本研究中，经H2S处理后，可明显减轻IRI睾丸组织的脂质氧化，同时可降低MDA含量，提高SOD水平。这表明外源性H2S对睾丸IRI引起的氧化应激产生了保护作用。

细胞凋亡是一种正常的生理现象， 也是一种基于遗传学机制的细胞死亡模式，通过诱导一系列形态和生化的改变导致细胞死亡的过程，在维持精子发生的动态平衡中起着重要的作用，凋亡过程的改变会使生精细胞发生异常凋亡[17。Hadziselimovic等[17]研究发现，睾丸IRI可使同侧睾丸细胞凋亡的发生率升高，且细胞凋亡的程度与缺血时间有关。Bcl-2是一组家族蛋白，其中包含促凋亡因子（如Bax）和抗凋亡因子（如Bcl-2），它们是近年来发现的一对关系密切的凋亡基因，在细胞凋亡调控过程中起着重要作用[18]。在人类凋亡通路级联反应中，Caspase是细胞凋亡机制中必不可少的组成部分，在多种发病机制中起着重要的作用。其中，Caspase-3是介导细胞凋亡的关键效应酶，是凋亡执行的关键效应分子，也是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点，它的活化是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志[19-20]。Bos等[20]发现外源性H2S可防止Caspase-3的激活，且通过H2S预处理也能防止IRI，从而肯定了H2S可通过抑制Caspase-3产生抗凋亡的作用。在本实验IRI组（B组）中，Bax/Bcl-2比值及Caspase-3表达明显高于对照组（A组）（P < 0.05）， 其生精细胞凋亡指数显著升高；经H2S干预后（C组），Bax/Bcl-2，Caspase-3的表达以及生精细胞凋亡指数较IRI组明显降低（P < 0.05）。以上实验结果证明H2S在睾丸缺血再灌注中具有抗凋亡作用。

综上所述，外源性H2S可减轻氧化应激水平和抑制生精细胞凋亡， 从而在睾丸组织IRI发挥保护作用，其作用机制还需要深入研究。以上这些发现为更好地理解新型气体信号分子H2S对泌尿生殖系统的作用提供了依据，无疑将为未来治疗睾丸IRI提供新的思路。

[参考文献]

[1] Tuglu D，Yuvanc E，Yilmaz E，et al. The antioxidant effect of dexmedetomidine on testicular ischemia-reperfusion injury [J]. Acta Cir Bras，2015，30（6）：414-421.

[2] Blank ML，O'Neill P ，Steigman CK，et al. Reperfusion injury following testicular torsion and detorsion in prepubertal rats [J]. Urol Res. 1993，21（6）：389-393.

[3] Dokmeci D. Testicular torsion，oxidative stress and the role of antioxidant therapy [J]. Folia Med （Plovdiv），2006， 48（3-4）：16-21.

[4] Kimura H. The physiological role of hydrogen sulfide and beyond [J]. Nitric Oxide，2014，41：4-10.

[5] Bozlu M，Acar D，Cayan S，et al. Protective effect of trapidil on long-term histologic damage in a rat model of testicular ischemia-reperfusion injury [J]. World J Urol，2009， 27（1）：117-122.

[6] Beheshtian A，Salmasi AH，Payabvash S，et al. Role of endogenous cannabinoids in ischemia/reperfusion injury following testicular torsion in rats [J]. Int J Urol，2008，15（5）：449-454.

[7] Tanaka H，Fujisawa M，Tanaka H，et al. Apoptosis-related proteins in the testes of infertile men with varicocele [J]. BJU Int，2002，89（9）：905-909.

[8] Lu M，Liu YH，Goh HS，et al. Hydrogen sulfide inhibits plasma renin activity [J]. J Am Soc Nephrol，2010，21（6）：993-1002.

[9] Yong QC，Lee SW，Foo CS，et al. Endogenous hydrogen sulphide mediates the cardioprotection induced by ischemic postconditioning [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008， 295（3）：H1330-H1340.

[10] Hosgood SA，Nicholson ML. Hydrogen sulphide ameliorates ischaemia-reperfusion injury in an experimental model of non-heart-beating donor kidney transplantation [J]. Br J Surg，2010，97（2）：202-209.

[11] Kimura Y，Goto Y，Kimura H. Hydrogen sulfide increases glutathione production and suppresses oxidative stress in mitochondria [J]. Antioxid Redox Signal，2010，12（1）：1-13.

[12] Turkmen S，Mentese A，Karaguzel E，et al. A comparison of the effects of N-acetylcysteine and ethyl pyruvate on experimental testicular ischemia-reperfusion injury [J]. Fertil Steril，2012，98（3）：626-631.

[13] Southorn PA，Powis G. Free radicals in medicine. I. Chemical nature and biologic reactions [J]. Mayo Clin Proc. 1988， 63（4）：381-389.

[14] 周玉，王伶俐，黃杨，等.糖尿病大鼠SOD活性与抗氧化剂治疗对机体抗氧化状态的影响[J].中国实验动物学报，2016，24（4）：422-426.

[15] Jiang D，Wu D，Zhang Y，et al. Protective effects of hydrogen rich saline solution on experimental testicular ischemia-reperfusion injury in rats [J]. J Urol，2012，187（6）：2249-2253.

[16] Turner TT，Tung KS，Tomomasa H，et al. Acute testicular ischemia results in germ cell-specific apoptosis in the rat [J]. Biol Reprod. 1997，57（6）：1267-1274.

[17] Hadziselimovic F，Geneto R，Emmons LR. Increased apoptosis in the contralateral testes of patients with testicular torsion as a factor for infertility [J]. J Urol. 1998，160（3 Pt 2）：1158-1160.

[18] Adams J M，Cory S. The Bcl-2 protein family：arbiters of cell survival [J]. Science. 1998，281（5381）：1322-1326.

[19] Voutsadakis I A. Apoptosis and the pathogenesis of lymphoma [J]. Acta Oncol，2000，39（2）：151-156.

[20] Bos EM，Leuvenink HG，Snijder PM，et al. Hydrogen sulfide-induced hypometabolism prevents renal ischemia/reperfusion injury [J]. J Am Soc Nephrol，2009，20（9）：1901-1905.