夏增飞，万成松

(南方医科大学，广州510515)

埃博拉病毒入侵、出芽及致病机制的研究进展

夏增飞，万成松

(南方医科大学，广州510515)

埃博拉病毒是一种结构简单的病毒，但其能在宿主内自行组装并在致病过程中引发一系列连锁反应，致使机体发生严重的免疫抑制和病理损伤。研究埃博拉病毒病的入侵、出芽及致病机制对于其治疗极其重要。埃博拉病毒的入侵是通过刺突蛋白与宿主细胞膜上的受体结合而实现的，其出芽过程比较复杂，主要是VP40蛋白在出芽中通过自体寡聚化后与Nedd4结合，实现对其他VP40蛋白的泛素化，最终与膜融合而出芽。埃博拉病毒的致病机制表现为多样性，主要是通过诱导有关的细胞因子，异常干扰有关的信号转导通路，从而抑制宿主免疫反应、造成机体组织病理损伤等。本研究就埃博拉病毒入侵、出芽及致病的相关机制作一综述。

埃博拉病毒；入侵；出芽；致病机制

埃博拉病毒于1976年在非洲首次被发现，目前为止一共发现五种亚型，2014年爆发的埃博拉疫情主要是由扎伊尔型(ZEBOV)引起的。埃博拉病毒的表面只有一种糖蛋白GP，该蛋白在病毒入侵、诱导细胞因子释放和机体免疫抑制等过程中发挥重要作用。埃博拉病毒所引发的临床症状多种多样，并且随着病情的发展而出现各种症状，但主要还是体现在免疫抑制和病理损伤两大方面。本文就埃博拉病毒的入侵、出芽及致病的相关机制作一综述。

1 埃博拉病毒入侵及其相关机制

埃博拉病毒入侵细胞的方式与其他病毒相似，是通过刺突蛋白与宿主细胞膜上的受体结合而实现的[1]。埃博拉病毒在局部淋巴结借助被感染的单核细胞、巨噬细胞和其他单核吞噬细胞(MPS)等，释放到淋巴和血液中，通过循环感染全身[2]。感染的细胞被异常激活，分泌大量炎性因子和趋化因子，并通过正反馈反应将细胞感染的过程放大，从而引发病毒的进一步入侵[3]。研究显示，人T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)胞外区远端的免疫球蛋白V区与病毒囊膜中的磷脂酰丝氨酸PS特异结合，可介导凋亡小体的内吞，而TIM的mucin区将特异性IgV结构域突出，可加强TIM与PS结合[4]。了解TIM识别和结合PS的分子机制是解码埃博拉病毒入侵细胞的关键，改变mucin区的长度或许可以对病毒通过内吞方式入侵细胞进行调控。埃博拉病毒的入侵可能与有被小窝和网格蛋白的内吞有关[5]。由于内吞泡直径的限制，有学者认为GP与受体结合可激活胞面的肌动蛋白调节分子，引发褶皱和胞饮机制，可能是病毒入侵的方式之一[5]。其次，埃博拉病毒是囊膜病毒，在入侵细胞过程中膜融合是关键的一步。但胞饮GP1和GP2在内体并不能独自完成构型变化，需要组织蛋白酶B和L将GP1切割为19 kD的片段[5]，该切割使病毒的融合蛋白构象发生变化，暴露出氨基末端结构域作为胆固醇转运蛋白配体，与NPC1编码的一种膜蛋白转运的胆固醇结合，从而对GP2的膜融合实现调控。在一种特殊酶调控和胞内触发信号下，19 kD的GP1片段在低pH条件下可以被触发结合脂质体，实现膜融合[5～7]。

GP是病毒结合宿主细胞的蛋白亚基，黏蛋白上的RBR区是GP结合的位置，提示病毒入侵细胞是通过膜转运作用，将GP-RBR结合部位转运到细胞表面[6]。淋巴细胞的内池有一个GP-RBR结合的部位，提示其或许是埃博拉病毒入侵免疫系统的一个特异途径，可为后继引发的免疫紊乱奠定基础。

2 埃博拉病毒出芽及其相关机制

VP24和VP40蛋白对于埃博拉病毒的组装、出芽过程具有重要作用，其中VP40作用更大。VP40蛋白中的Late-domain保守模体是病毒组装出芽最重要的部分，分为PTAP、PPXY和YXXL。目前大部分文献所认可的组装、出芽过程：VP40单体首先通过C端与多囊泡体(MVB)结合，形成VP40-MVB复合物，使得VP40蛋白构象发生变化，从而发生自体寡聚化。Nedd4与VP40的PPXY模体结合后，能够泛素化VP40蛋白和邻近蛋白；Tsgl01与转运必需内体分选1(ESCRT-1)复合物结合后，再协同ESCRT复合物Ⅱ和ESCRT复合物Ⅲ，与泛素化的VP40-MVB复合物结合，一起被运送到质膜。在质膜上，VP40-MVB复合物与一种病毒蛋白三聚体结合，并在ESCRT复合物Ⅲ诱导下，逐渐形成小泡。ESCRT复合物Ⅲ还能促进成熟毒粒的聚集，最终导致毒粒的释放[8]。因此，Late-domain与细胞因子的相互作用可以促进埃博拉病毒的出芽过程。但Nedd4只能与寡聚体发生反应，而VP40蛋白只有在与细胞膜结合后才可以发生自体寡聚化，提示该过程是在VP40蛋白与细胞膜结合之后发生的[8～10]。因此，埃博拉病毒的组装和出芽必须要经过膜融合来启动相关部件。

3 埃博拉病毒致病及其相关机制

3.1 抑制宿主免疫反应 病毒通过典型的C型凝集素或其他模式识别受体进入未成熟的单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DCs)，使细胞成为功能未放开和无法表达共刺激分子或前炎性细胞活素的淋巴细胞，即幼稚T细胞。该过程是病毒入侵免疫系统的首要步骤[11,12]。

3.1.1 关闭先天性免疫应答 病毒感染后会导致严重的免疫抑制，包括抑制组织相容性复合体1(MHC-1)蛋白的基因表达以及对IFN-α、IFN-γ靶基因的诱导[13]。这些因子均在免疫反应中发挥主要作用，其表达抑制会直接降低机体的免疫功能[14]。在先天性免疫应答过程中，病毒蛋白可终止机体细胞内蛋白信号转导和活化因子1(STAT1)的积累，进一步阻断p38 MAP激酶通路(JAK-STAT通路)，其机制为：VP24阻断JAK-1的同源二聚化和TYK-2的异源二聚化，抑制转录因子的核定位以及IFN激活基因ISG表达，从而抑制IFN的产生[15]；而VP35可干扰IFN和IFN诱导基因产物(ISG)的合成表达，阻断干扰素调节因子3(IRF-3)，即依赖双链RNA蛋白酶的磷酸化来降低其活性，同时促进IRF-7失活，降低IFN的作用，抑制多种共刺激分子如CD40、CD80、CD86和MHC2的表达上调及巨噬细胞分化；受感染的巨噬细胞还能分泌NO，从而促进细胞凋亡的发生[16,17]。以上各步骤综合作用，并互相加强，使周围的正常细胞失去保护[17,18]。由于Ⅰ型IFN在反应时同时启动一个负反馈回路，用于调节机体对病原体的先天性免疫应答[19]，故病毒对Ⅰ型干扰素的抑制会对机体的先天性免疫应答造成严重影响。病毒蛋白如VP35有多个固有免疫拮抗域，可以协同抑制DCs的成熟[20]，提示埃博拉病毒不依赖其他机制也可以直接抑制先天性免疫应答。

3.1.2 关闭获得性免疫应答 先天性免疫应答的关闭，导致DCs在感染后无法释放集落刺激因子等细胞因子，进而抑制MHC的表达并激活淋巴细胞，出现Ⅰ型MHC的表达和抗原呈递能力的严重下降，从而影响体液和细胞免疫应答，导致获得性免疫应答障碍[1]。另外，由于埃博拉病毒的GP具有表位伪装和原子空间遮盖作用，sGP的免疫欺骗及其导致的sGP特异性免疫细胞对GP的竞争，导致抗体识别度下降，抗原呈递细胞无法识别抗原，最终大大降低体液免疫效果[21]。至于细胞免疫，埃博拉病毒感染细胞可以通过TRAIL和Fas-Fasl途径，抑制CD4和CD8 T淋巴细胞的产生，病毒糖蛋白C末端免疫抑制性基序对免疫细胞的识别使CD4和CD8 T淋巴细胞数量持续降低，致使重要免疫器官坏死，最终大大降低细胞免疫[21]。

3.1.3 病毒免疫逃逸 埃博拉病毒感染宿主细胞后，早期分泌大量sGP，并通过CD16b(中性粒细胞Fc-受体的一种形式)与中性粒细胞结合，抑制其活化，使机体炎症反应减少，有助于病毒逃避免疫的监视攻击[22,23]。另外，sGP具有与GP相同的结合位点，具有欺骗性，可以与中和性抗体结合来欺骗免疫系统，帮助GP等关键抗原逃避中和[23]。病毒胞膜糖蛋白的黏蛋白样区MLR是宿主免疫攻击的位点，但其高度糖基化遮盖了攻击位点[17]。GP亦可在MHC-1、β1整合素和GP本身的抗原表位发生立体屏蔽，阻止CD8 T淋巴细胞识别MHC-1[6,24]；还可降低细胞表面MHC-1的表达，最终造成免疫逃逸[25]。另外有研究发现，淋巴细胞增殖是由有丝分裂原刺激启动的，而GP的N端序列可以对有丝分裂原进行移植，从而抑制淋巴细胞的产生，造成免疫抑制[8]。

3.2 导致机体组织病理损伤

3.2.1 弥漫性血管内凝血(DIC) 埃博拉病毒感染引起的凝血障碍是导致患者死亡的重要原因。因该过程涉及的细胞因子很多，又与其他信号转导途径交叉，因此临床治疗非常困难[19]。埃博拉病毒入侵机体后，在病毒的致病作用下，MPS(主要是单核细胞和巨噬细胞)释放许多与凝血功能异常密切的因子，包括细胞因子和趋化因子等细胞活性物质。单核-巨噬细胞系统刺激组织因子(TF)过度表达触发DIC，同时启动凝血因子Ⅸ和Ⅹ，启动内外源性两种凝血酶级联放大效应[26,27]，阻碍凝血级联反应正常运转。TNF-α通过多种机制介导增加血管内皮细胞的通透性，使血管完整性遭到破坏；TNF-α还可降低抗凝活性，上调白细胞和血小板黏附因子表达，造成血管渗漏[20,28]。GP1、GP2和VP40作用于内皮细胞，可使血管通透性进一步升高，而NO水平上升引起血管扩张导致有效血容量减少，直接改变内皮细胞的形态和功能，诱导淋巴细胞死亡，进一步增加组织损伤和血管通透性[26,29]。同时，组织破坏后血管壁胶原暴露释放组织因子，而抗凝蛋白C、凝血因子ⅩⅣ等在微血栓形成过程中会快速消耗，微循环障碍导致微血管灌注不足，肝脏损伤导致凝血因子产生不足，血浆纤维蛋白溶解产物增加，抗原呈递细胞释放趋化因子对血管内皮细胞产生破坏作用[26]，最后导致DIC。埃博拉病毒破坏了机体的凝血平衡并造成血管损伤，导致进一步的出血性休克和器官衰竭，最后引发死亡[2,30]。

3.2.2 炎症反应 埃博拉病毒感染的单核细胞和巨噬细胞释放多种促炎症因子，包括TNF-α、IL-1β、生长调节蛋白α(CRO-α)、巨噬细胞炎性蛋白α1(MIP-1)、活性氧(ROS)和NO等[31]，引导单核细胞和巨噬细胞进一步聚集，增加病毒的复制并通过体循环加速其传播扩散，激活中性粒细胞，诱导多形核细胞脱颗粒，以正反馈的方式扩大炎症反应[1,21]。在埃博拉病毒感染晚期，IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10表达受到抑制，而IL-1β、IL-6和转化生长因子β则呈现高表达[19]。炎性反应是先天性免疫和获得性免疫的关键，可控制病毒的复制和诱导特异性免疫应答，早期适当的炎性反应有助于机体限制病毒的复制和扩散，后期则可能引起高病毒血症和细胞因子风暴[20]。

3.2.3 细胞因子风暴 细胞因子风暴指疾病晚期出现的免疫系统异常过度活化反应，其根本原因是免疫应答的初期抑制[20,32]。细胞因子风暴可导致细胞损伤，细胞损伤又进一步引发新的细胞因子风暴，增加感染细胞数量，支持病毒复制等；如此循环，埃博拉病毒感染后期血管通透性增加，使病情更加严重[12,20]。

3.2.4 GP诱导细胞病变 在埃博拉病毒感染晚期，GP高度糖基化的黏蛋白样区会使感染细胞产生形态学和病理学改变，主要表现为细胞变圆脱落、细胞外基质分离以及细胞表面整合素β1和MHC-1水平下降、细胞功能受损等，也是血管内皮细胞损伤的一种途径[6]。此外GP还可降低整合素αVβ3水平，导致细胞脱落死亡，但是这种作用可以被布雷非德菌素A抑制[25]。

虽然目前非洲的埃博拉病毒疫情已经解除，但是对于其致病机制仍无法阐释，针对该病毒的疫苗也正在研发过程中，进一步研究该病毒的致病机制和疫苗研发对于控制埃博拉病毒疫情具有重要意义。参考文献：

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广东省科技计划项目(2015A020213003)。

万成松(E-mail: gzwcs@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.036

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1002-266X(2017)16-0105-04

2016-10-05)