郭 锐， 田永祥， 周丹娜， 段正赢， 杨克礼， 刘泽文， 袁芳艳， 刘 威

(1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所农业部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室 ， 湖北武汉430064 ；2.动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室 ， 湖北武汉430064)

羊口疮病毒湖北株B2L基因的克隆与遗传进化分析

郭 锐1,2， 田永祥1,2， 周丹娜1,2， 段正赢1,2， 杨克礼1,2， 刘泽文1,2， 袁芳艳1,2， 刘 威1,2

(1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所农业部畜禽细菌病防治制剂创制重点实验室 ， 湖北武汉430064 ；2.动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室 ， 湖北武汉430064)

为了分析羊口疮病毒湖北株(ORFV-HB-YX株)B2L基因遗传变化规律，参照GenBank公布的ORFV-B2L基因序列设计特异性引物，对ORFV-HB株B2L基因进行PCR扩增、克隆、测序以及遗传进化分析。结果显示，B2L基因PCR扩增产物大小为1 137 bp，编码379个氨基酸，系统进化树显示HB-YX株与GenBank参考毒株的核苷酸序列同源性为97.0%～99.0%，与福建FJ-GS株同源性高达99%亲缘关系最近，属于同一分支。

羊口疮病毒 ； B2L基因 ； 克隆 ； 遗传进化分析

羊口疮(ORF)又称羊传染性脓疱口炎或羊传染性脓疱等，是由羊口疮病毒(orfvirus,ORFV )所引起的一种绵羊和山羊的高度接触性人兽共患传染病，也会感染其他野生反刍动物如鹿、麝牛等，以羔羊最为易感[1]。近年来，羊口疮在湖北省境内临床病例呈逐渐上升趋势，以口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水疱、脓疱和结成疣状结痂为特征[2]，同时容易继发细菌感染，如：葡萄球菌、链球菌和变形杆菌等，以羔羊发病为主，死亡率严重的可达30%。

ORFV的基因组结构极其复杂，为线性dsDNA，其长度为134～139 kb。目前公认的ORFV基因组共包含约130多个基因，由两个相同的反向末端重复区(ORFs 001～008和 ORF112～134)和中央编码区(ORFs 009～111) 组成。B2L基因分别位于羊口疮病毒11个完整开放阅读框，高度保守，编码42 kD蛋白。42 kD蛋白是病毒囊膜的主要成分之一，能刺激机体产生强烈的抗体反应，并能引起淋巴细胞增殖。该蛋白与痘苗病毒p37k蛋白的氨基酸同源性达42%。用痘苗病毒在羊体内表达此蛋白能刺激羊只产生强烈的抗体反应，并刺激淋巴细胞释放。虽然ORFV以细胞免疫为主，但国内外学者仍高度重视该蛋白良好的免疫原性，一些研究者用B2L 基因与病毒囊膜亚单位中的其他保护性抗原基因进行重组，以期获得能对机体产生有效保护的基因工程苗[3]。国内王廷璞等通过B2L基因与pGEM-4Z载体重组，已筛选出具有较高表达水平且能传代的重组菌[4]。本试验针对HB-YX株的B2L基因进行分子特征分析，旨在了解HB-YX株与国内毒株及国际毒株间的差异，以便深入了解羊口疮贵州株的分子特性，有助于阐明ORFV致病机制与新型疫苗研究,有助于ORF的综合防控。

1 材料与方法

1.1 材料 羊口疮病毒湖北株(HB-YX株)由本实验室保存；pMD18-T载体、DNA限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ、rTaqDNA、E.coliDH5α聚合酶，购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒，均购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 病毒DNA的提取 按照DNA提取试剂盒说明书操作提取病毒DNA并-20 ℃保存。

1.3 引物设计与合成 根据GenBank中公布的B2L基因序列(登录号：DQ184476)并参考文献设计1对特异性引物，上游引物P1：5′-CGGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTC-3′；下游引物P2：5′-CCAAGCTTTTAATTTATTGGCTTGCAGAACT-3′，预期扩增片段大小为1 100 bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 HB-YX株B2L基因的扩增 用1.2提取的DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系体积为50 μL，其中10 μmol/L浓度的上下引物各1 μL，模板5 μL，2×EasyTaqPCR Mix 25 μL，剩下添加ddH2O至50 μL。反应程序：95 ℃ 预变性5 min；95 ℃变性30 s，68 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。

1.5 重组质粒的构建及鉴定 重组质粒的构建及鉴定反应体系为10 μL，依次加入PCR产物5 μL、pMD18-T载体1 μL、连接缓冲液4 μL，16 ℃连接4 h。取5 μL连接产物转化用DH5α感受态细胞，涂于含氨苄青霉素的LB平板，37 ℃培养过夜。从平板上挑取单菌落接种于3 mL含氨苄青霉素的LB培养液，37 ℃振荡培养过夜。用菌液提取质粒，进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定。将酶切鉴定为阳性的重组质粒送到上海生工生物工程技术服务有限公司测序，利用基因分析软件MegAlign5.0对测序结果进行分析，参考毒株信息(见表1)。

2 结果与分析

2.1 HB-YX株B2L基因的扩增 进行PCR扩增后得到1 137 bp的片段，与预期相符(见图1)。

表1 参考毒株信息

图1 HB-YX株B2L基因PCR扩增电泳图

M：DL-2 000 Marker； 1：羊口疮病毒

2.2 重组质粒的酶切鉴定 提取重组质粒pMD18-T-B2L后，选用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，获得两条大小为2 692 bp和1 137 bp左右的基因片段，分别与预期基因片段大小相符(见图2)。

图2 重组质粒PCR鉴定

M,DL-5 000 Marker；1，重组质粒pMD18-T-B2L

2.3 HB-YX-B2L基因片段的基因氨基酸序列同源性分析 将HB-YX株和GenBank中公布的23个不同ORF毒株的B2L基因氨基酸序列用MegAlign 5.0软件进行同源性在97.0%～99.0%。结果发现该毒株与福建FJ-GS株同源性高达99%亲缘关系最近，为同一分支(见图 3)。

3 讨论

近些年以来，养羊在湖北省养殖业的比重日益增加，截止到2014年，湖北省山羊存栏达469.89万只，羊肉产量达8.61万吨。羊口疮是一种人兽共患病，同时也是养羊过程中的高发疫病之一。该病对羔羊危害最大，主要原因是羔羊机体免疫力下降，在经受外界刺激情况下此时山羊体内已经受羊口疮病毒隐性感染，极易出现排毒现象，导致羊口疮的暴发，死亡率可高达30%以上。目前尚无治疗羊口疮特效药，对该病的预防工作就显得尤为重要。本人通过总结大量临床病例，在羔羊产后1周时间内，每天检查1次口腔，只要发现红色小包立即注射抗生素(如头孢曲松)，按照使用剂量1天两次，连用3 d，即可有效控制疫情。初期在口腔内难以发现病灶，一旦错过有效治疗期，治疗效果将大打折扣。

虽然ORFV以细胞免疫为主，但国内外学者仍高度重视该蛋白良好的免疫原性，一些研究者用B2L基因与病毒囊膜亚单位中的其他保护性抗原基因进行重组，以期获得能对机体产生有效保护的基因工程苗[3]。国内王廷璞等通过B2L基因与pGEM-4Z载体重组，已筛选出具有较高表达水平且能传代的重组菌[4]。

本试验成功克隆出了HB-YX株B2L基因，序列全长为1 137 bp，通过与国内外已公布序列对比发现，总的来说ORF-B2L基因同源性在97.0%～99.0%，HB-YX株与福建FJ-GS株同源性最高达99.0%，同属于一个分支，通过核苷酸序列对比发现存在一定的基因突变现象，突变主要集中在个别位点1～3个碱基，没有出现本人之前检测的HB-YX株F1L基因存在的连续12个碱基缺失的情况[5]。本试验阐明了湖北省羊口疮流行毒株的B2L基因变异情况，为进一步阐明湖北省羊口疮病毒遗传变化规律提供了依据，也为今后新的ORF疫苗的研制奠定基础。

[1] 殷震,刘景华.动物病毒学[M].北京:科学出版社,2008:423-445.

[2] Abrahao J S,Campos R K,Trindade G S,etal.Detection and phylogenetic analysis of Orf virus from sheep in Brazil:a case report[J].Virol J,2009,6:47

[3] 杨海波,贺志昊，刘昱成，等.羊口疮病毒新疆野毒株SHZ1 B2L和F1L基因的克隆及遗传进化分析[J].石河子大学学报2013,31(3):323-327.

[4] 赵魁.羊传染性脓疱病毒重组DNA疫苗的构建与实验免疫研究[D].长春:吉林农业大学,2010.

[5] 郭 锐,田永祥,周丹娜,等.羊口疮病毒湖北株F1L基因的克隆与遗传进化分析[J].中国草食动物科学,2015,35(6):31-33.

Cloning and Phylogenetic Analysis of B2L gene of orf virus isolated in Hubei

GUO Rui1,2, TIAN Yong-xiang1,2, ZHOU Dan-na1,2, DUAN Zheng-ying1,2,YANG Ke-li1,2， LIU Ze-wen1,2， YUAN Fang-yan1,2， LIU Wei1,2

(1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Hubei Academy of Agricultural Science,key laboratory of prevention and control agents for animal bacteriosis (ministry of Agriculcure), Wuhan 430064,China; 2.Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding, Wuhan 430064, China)

In order to analyze the orf virus Hubei strain (ORFV-HB-YX strain) genetic variation of B2L gene,specific primers were designed for-B2L ORFV gene based on the sequence published in GenBank,B2L gene of ORFV-HB strain was amplified,cloned and sequenced,and the genetic analysis of B2L gene was carried out.Results showed that the PCR product of gene B2L was 1137bp.encoding 379 amino acids,Phylogenetic tree showed that the homology of nucleotide sequence of HB-YX strain and GenBank strain was 97.0%～99.0%,and the homology was 99% when compared with the Fujian FJ-GS strain. HB-YX strain and the Fujian FJ-GS strain belong to the same branch.

Orf virus ; B2L gene ; clone ; phylogenetic analysis

TIAN Yong-xiang

2016-04-29

湖北省农业科技创新中心资助项目(2016-620-000-001-026)；动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室开放课题项目(2016ZD150)；国家公益性行业(农业)科研专项(201303035)

郭锐(1981-)，男，助理研究员，硕士，主要从事动物疫病防控研究，E-mail：hlguorui@163.com

田永祥，E-mail：tyxanbit@163.ocm

S852.65

A

0529-6005(2017)02-0037-03