盘宝进 ， 温和心， ， 龙英全 ， 蒋荣华 ， 陈立军 ， 何成伟 ，罗 佳

(1.广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心， 广西南宁530021；2.贵港出入境检验检疫局， 广西贵港537100 ； 3.凭祥出入境检验检疫局， 广西凭祥530002)

双重荧光环介导扩增检测猴空肠弯曲杆菌和小肠结肠炎耶尔森菌

盘宝进1， 温和心1，2， 龙英全2， 蒋荣华2， 陈立军1， 何成伟3，罗 佳1

(1.广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心， 广西南宁530021；2.贵港出入境检验检疫局， 广西贵港537100 ； 3.凭祥出入境检验检疫局， 广西凭祥530002)

本试验在环介导恒温扩增体系引入分子信标建立双重荧光环介导扩增方法，利用该方法检测实验猴空肠弯曲杆菌和小肠结肠炎耶尔森菌，结果敏感性分别达到10-2CFU/mL和10-3CFU/mL，与常见肠道菌无交叉反应。

双重荧光环介导扩增 ； 检测 ； 空肠弯曲杆菌 ； 小肠结肠炎耶尔森菌

空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni，CJ)和小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica，YE)是一种在世界范围内广泛流行的人兽共患病的病原菌，主要引起人类的急性肠炎。空肠弯曲杆菌已经取代沙门菌成为发达国家最常见的腹泻病病原菌之一，小肠结肠炎耶尔森菌能在冷藏温度下(0 ℃～4 ℃)生长繁殖，俗称“冰箱菌”，国外已将两种菌列为进口实验动物检疫项目[1]。当前我国两种菌的检疫标准采用培养鉴定法[2-3]，CJ菌培养条件苛刻，微需氧菌，曝露在空气中过久(国标要求不超过0.5 h)细菌会死亡，培养成功率低。YE菌检验要经过低温增菌，该法耗时长，需要1周时间。环介导恒温扩增技术(LAMP)具有扩增效率高、设备简单等优势。分子信标能与DNA扩增产物特异结合，不同荧光素标记的探针可以实现多重项目检测。本试验是在环介导扩增反应体系中引入分子信标，分子信标环部与LAMP产物环部特异结合后，茎部打开发出荧光信号，最终实现双重荧光LAMP检测CJ菌和YE菌DNA，显著缩短了检测时间。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和设备 DNA大片段聚合酶试剂盒(广州华锋公司)，脱氧核苷酸(Invitrogen)，羟基萘酚蓝(HNB，AR，Sigma)，甜菜碱(AR，Sigma)，硫酸镁(AR，Sigma)，矿物油(Merk)，LAMP引物、分子信标，TaqMan探针均由TaKaRa合成，标准菌株(广东环凯公司)。

荧光PCR仪(ABI 7500)，水浴锅(上海一恒，HWS24)，离心机(Sigma 2-16PK)、电泳仪(北京六一，DDY-2C)，凝胶成像系统(WD-9403D，北京六一)，移液器(Ependorf)，生化培养箱(上海实验仪器厂，SHP-180)；超纯水系统(Milli-Q)。

1.2 菌株培养计数 CJ菌培养条件为42 ℃微需氧环境(85% N2、10% CO2、5% O2)，用Mueller-Hinton(MH)液体培养基过夜，取菌液系列稀释，涂布于Mueller-Hinton(MH)固体培养基中，24 h计算菌落数。YE菌用营养肉汤培养过夜，菌液用营养琼脂培养计数，培养条件为37 ℃需氧环境。

1.3 LAMP引物与分子信标设计

1.3.1 LAMP引物设计 Primerexplorer V 4.0在线软件针对YE菌基因设计若干组引物，含内引物(F3、B3)、外引物(FIP、BIP)。对合成的引物进行LAMP试验，选定反应性、特异性、敏感性高的引物组。

表1 LAMP引物

1.3.2 分子信标设计 信标茎区序列均为：CCGGCG(Tm 65 ℃)，CJ菌5′端标记Cy5，YE菌5′端标记FAM，3′端均标记淬灭基团DABCYL。分子信标环区与LAMP产物的哑铃环区结合，通过增减环区序列碱基长度，分别设计含梯度融链温度(Tm)环区的3个分子信标。见表2。

表2 分子信标环部设计

1.4 反应体系

1.4.1 基础LAMP反应体系 Bst酶缓冲液(10×)2.5 μL，Bst酶(8 U/μL)1 μL，引物(各引物浓度均20 μmol/L，F3：B3：FIP：BIP =1∶1∶8∶8)4.5 μL，dNTP(10 mmol/L each)3.5 μL，MgSO4(100 mmol/L)1.5 μL，betaine(5 mol/L)4 μL，DNA模板1 μL，加dH2O至25 μL。反应程序：65 ℃水浴1 h，80 ℃水浴2 min终止反应。产物用琼脂糖凝胶电泳分析扩增情况。

1.4.2 可视化LAMP反应体系 即在基础LAMP反应体系上加入HNB((2 mmol/L)至终浓度为 150 μmol/L，加dH2O至25 μL。反应结束后目测反应液由深蓝色变成蓝绿色判为阳性，深蓝色无变化判为阴性。

1.4.3 荧光LAMP反应体系 即在基础LAMP反应体系上加入分子信标至终浓度为0.4 mmol/L，加dH2O至25 μL，在荧光PCR仪上扩增读取荧光信号。

1.5 荧光LAMP反应程序的优化 等温模式，即LAMP扩增和分子信标结合均维持恒定65 ℃，扩增1 min，信标结合10 s后读取荧光信号，共40个循环。分别试验CJ菌和YE菌各Tm值信标在LAMP反应性能。变温模式，即LAMP在65 ℃，扩增1 min，分子信标在较低温度下退火，10 s后读取荧光信号，共40个循环。分别试验60 ℃、55 ℃、50 ℃、45 ℃3个退火温度，比较CJ菌和YE菌各Tm值信标在各退火温度LAMP的敏感性。根据结果评价两种反应程序的优劣，确定荧光LAMP的最优反应程序。

1.6 双重荧光LAMP敏感性与其他分子生物学方法比较试验 分别将CJ DNA和YE DNA稀释成1×106～1×100CFU/mL 6个浓度梯度，进行CJ/YE双重荧光LAMP反应，反应结果Ct值<35判为阳性。同时对各梯度进行电泳法和HNB染料法LAMP反应，和PCR、荧光PCR反应，与比较各种方法的敏感性。

1.7 双重荧光LAMP特异性分析 大肠杆菌、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、李斯特菌、溶血性链球菌、粪链球菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌等8种肠道菌标准菌株纯培养(≥106CFU/mL)后热裂解法提取DNA，加入CJ-YE双重荧光LAMP体系进行反应，鉴定试验的特异性。

1.8 双重荧光LAMP与其他几种方法检测样品符合性试验采集1 000个试验猴样品，每只采4份肛拭子，1份用Mueller-Hinton培养液42 ℃微需氧环境对CJ菌增菌，1份用营养肉汤培养37 ℃对YE菌增菌，各增菌24 h后，取上层液体1 mL离心弃上清，沉淀用纯水反复洗涤2遍，最后沉淀加100 μL纯水复溶，沸水中煮沸10 min，12 000 r/min离心10 min，取上清分别用于荧光LAMP、显色LAMP、荧光PCR、PCR方法检测，同时1份肛拭子按国标GB/T 14926.49-2001检测CJ菌，1份按GB/T 4789.8-2008检测YE菌。比较以上几种方法的检测结果的符合性。

2 结果

2.1 CJ、YE菌DNA LAMP电泳法和显色法试验结果 LAMP产物琼脂糖凝胶电泳结果显示，阳性组出现典型的梯状扩增条带(图1-A、2-C：1)，而阴性对照未见扩增条带(图1-A、2-C：2)。显色法LAMP扩增过程中，阳性管颜色逐渐转绿，1小时反应结束后，如图1-B和2-D，阳性组颜色由深蓝变成蓝绿(图1-B、2-D：1)，阴性组仍保持深蓝色无变化(图1-B、2-D：2)。以上结果充分表明所设计的2套LAMP引物组能正确扩增目标DNA，所建立的LAMP反应体系有效且稳定。

图1 CJ DNA LAMP电泳法和显色法试验结果

A：CJ DNA LAMP产物电泳； B：CJ DNA可现LAMPM：DNA Marker； 1：CJ DNA； 2：阴性对照

图2 YE DNA LAMP电泳法和显色法试验结果

C：YE DNA LAMP产物电泳； D：YE DNA可视LAMPM：DNA Marker； 1：YE DNA； 2：阴性对照

2.2 荧光LAMP反应程序试验 65 ℃等温荧光扩增CJ DNA和YE DNA，结果见表3，多数Tm值的分子信标都有不同程度的荧光信号产生，较高Tm值信标组敏感性较低Tm值组高，Tm 65 ℃组敏感性最高，CJ DNA和YE DNA最低检出限分别是104CFU/mL和105CFU/mL，敏感性太差无应用价值。Tm 60 ℃组次之，当信标Tm低至55 ℃时无荧光信号产生。可见等温荧光LAMP结果表明分子信标不能高效地与LAMP产物结合，难以获得较高的检测灵敏度。

表3 等温荧光LAMP试验结果

菌液浓度单位：CFU/mL； +：阳性； -：阴性

变温荧光扩增CJ DNA和YE DNA，结果见表4，在一定退火温度下，较高Tm值信标组荧光敏感性高于较低Tm组。退火温度低于信标环部Tm值10 ℃～15 ℃时可以获得较强的荧光信号，低少于10 ℃荧光信号显著降低，高多于15 ℃则容易产生假阳性。综合荧光LAMP信标和Bst酶的特性，选择环部Tm值65 ℃的信标，退火温度50 ℃，荧光LAMP敏感性最高，CJ DNA和YE DNA最低检出限分别是102CFU/mL和103CFU/mL。

2.3 双重荧光LAMP敏感性与其他分子生物学方法比较试验结果 双重荧光LAMP敏感性和其他方法比较结果见表5，双重荧光LAMP法检测CJ DNA和YE DNA的检出限分别是102CFU/mL和103CFU/mL，敏感性高于LAMP电泳法、显色法和菌液浓度单位：CFU/mL； FN：False negative，假阴性； FP：Falsepositive，假阳性PCR法，稍低于荧光PCR法。

表4 变温荧光LAMP试验结果

表5 CJ DNA/YE DNA双重荧光LAMP敏感性与其他方法比较结果

菌液浓度单位：CFU/mL； +：阳性； -：阴性； NC：阴性对照

2.4 双重荧光LAMP特异性试验结果双重荧光LAMP特异性试验见图4，只有CJ和YE菌DNA产生较强的荧光信号，大肠杆菌、伤寒沙门菌、痢疾志贺菌、李斯特菌、溶血性链球菌、粪链球菌、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌等8种肠道菌未见荧光信号产生，表明该双重荧光LAMP对CJ菌和YE菌有较强的特异性。

图4 双重荧光LAMP特异性试验

2.5 双重荧光LAMP与分离培养法、荧光PCR法符合性检验对1 000份实验猴样品检测结果见表6，CJ菌和YE菌的检测结果一致表明，各方法检测敏感性次序是：荧光PCR>荧光LAMP>显色LAMP≈PCR>分离培养，荧光PCR敏感性最高，荧光LAMP敏感性略低于荧光PCR但高于PCR，分离培养法敏感性显著低于分子生物学方法，尤其是CJ菌培养法敏感性更低。

表6 双重荧光LAMP与其他方法符合检验

3 分析讨论

3.1 荧光LAMP分子信标的设计。分子信标环部是一段与LAMP扩增产物环部DNA互补的一段序列，一般软件设计的LAMP引物的扩增产物环部大多在10 bp～25 bp长度，与之对应，信标环部一般不超过25 bp，其Tm值多数处于60 ℃～65 ℃范围内，少见超过68 ℃，虽然高GC含量的序列可获得更高Tm值，但该类DNA结构复杂，难以被扩增[4]。

3.2 荧光LAMP反应程序。Bst酶反应的最适温度是65 ℃，荧光LAMP若在等温下进行，分子信标在65 ℃退火，信标环部的Tm值必须比退火温度高 7 ℃～10 ℃即68 ℃～75 ℃，才能取得理想的退火效果[5]，设计高Tm值的环部意味较长序列高GC含量，这是较难实现的，所以选择65 ℃等温扩增使分子信标的设计困难重重。选择低于65 ℃温度扩增和退火虽然方便分子信标的设计，但会大幅降低Bst酶的活性，使扩增效率降低，选择高于65℃温度扩增和退火，Bst酶则迅速失活致实验失败。由于Bst酶活性温度和分子信标设计的局限，荧光LAMP选择变温模式，即在65 ℃扩增，50 ℃下退火，可以有效地解决以上难题，敏感性有大幅提高。与50 ℃退火温度对应，分子信标环Tm值在60 ℃～65 ℃，提高信标设计成功率。

3.3 分离培养法一是肛拭子非目标菌量大且杂，目标菌被掩盖，二是由于CJ菌在有氧环境下易死亡，且培养条件苛刻，培养成功率不高，从而导致检出率低，阳性率远低于分子生物学方法。本研究在环介导扩增技术基础上引入分子信标，通过分子信标的设计和LAMP反应程序的优化，实现荧光环介导扩增，检测敏感性虽未达到荧光PCR水平，但该技术仍处于研究初级阶段，LAMP扩增效率理论上达到109～10拷贝[6]，表明荧光环介导扩增技术还有较大的提升潜力。

[1] 杨绍基，任红.传染病学[M].北京：人民卫生出版社，2008：156.

[2] GB/T14926.49-2001.实验动物空肠弯曲杆菌检测方法[S].

[3] GB/T4789.8-2008.食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验[S].

[4] Mamedov T G，Pienaar E，Whitney S E.A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates[J].Comput BiolChem，2008，32(6)：452-457.

[5] Dieffenbach C W，Dveksler G S.PCR primer a laboratory manual[J].USA：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995，143-153.

[6] Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，etal. Loop-mediated iso?thermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research，2000.

2015-03-06

国家质检总局科研项目(2013IK030)；广西科技攻关项目(桂科攻1347003-8)

盘宝进(1966-)，男，研究员，硕士，主要从事动物检验检疫与科研工作，E-mail：295755098@qq.com

R378.2

B

0529-6005(2017)02-0033-04