卢冰霞 ， 梁家幸 ， 段群棚 ， 陈忠伟 ， 蒋冬福 ， 卢敬专 ， 周英宁 ，闭炳芬 ， 何 颖 ， 秦毅斌 ， 李 斌 ， 苏乾莲 ， 赵 武

(广西兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室， 广西南宁530001)

8株鸽源新城疫病毒广西分离株HN基因的遗传进化分析

卢冰霞 ， 梁家幸 ， 段群棚 ， 陈忠伟 ， 蒋冬福 ， 卢敬专 ， 周英宁 ，闭炳芬 ， 何 颖 ， 秦毅斌 ， 李 斌 ， 苏乾莲 ， 赵 武

(广西兽医研究所广西兽医生物技术重点实验室， 广西南宁530001)

应用RT-PCR方法对分离自广西不同鸽场的8株鸽源NDV广西分离株HN基因进行扩增、序列测定和分析，旨在探讨广西鸽源NDVHN基因的分子进化特点，为科学防控鸽源新城疫提供依据。结果显示，8株鸽源NDV广西分离株HN基因的ORF全长均为1 716 bp，编码571个氨基酸，属于强毒的C群，符合强毒株的基因长度特征。核苷酸同源性比较显示，8株鸽源NDV分离株与NDV基因Ⅵ型中的Ⅵb亚型同源性最高，为90.4%～99.5%。遗传进化分析显示，8株鸽源NDV广西分离毒株与我国2011-2013年广西、广东、吉林、辽宁、云南、黑龙江等地鸽源NDV分离株的遗传关系较为接近，位于同一进化树分支上，初步推测8株鸽源NDV广西分离株应属于classⅡ基因Ⅵb亚型NDV。

鸽； 新城疫病毒；HN基因； 遗传进化

新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一种能使多种禽类感染的急性、高度接触性、致死性传染病，给世界养禽业造成巨大的经济损失。NDV是副黏病毒科、副黏病毒亚科、禽腮腺炎病毒属的成员，为有囊膜、单股负链RNA病毒，基因组全长约为15 kb，由3′到5′端依次编码核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶(HN)和大蛋白(L)这6种病毒蛋白。鸽源新城疫病毒(PigeonNewcastleDiseasevirus，PNDV)，也称为鸽源禽Ⅰ型副黏病毒(PigeonParamyxovirusTypeⅠ，PPMV-1)为NDV成员之一[1]。已被公认，HN蛋白对细胞融合作用是必须的[2]。HN蛋白兼具以下几种生物功能：即在NDV侵染过程中识别靶细胞的唾液酸受体；介导病毒吸附细胞膜，促进新病毒粒子的释放；促进融合功能；病毒毒力和抗原性的决定等[3]。最近研究发现，F蛋白并不是导致NDV毒力强弱的惟一因子，单独HN蛋白也可发挥作用[4]。抗体免疫选择压可显著影响HN基因变异,且其受影响程度高于F基因[5]，因此HN基因的变异更能代表NDV的进化规律和趋势。本试验应用RT-PCR方法对广西地区2011-2014年间获得的8株鸽源NDV分离株的HN基因进行扩增及序列测定，应用软件将其与国内外不同NDV毒株进行序列分析比较，并构建系统进化树，旨在研究鸽源NDV广西分离株的遗传变异趋势，为广西鸽ND疫情的监测和防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 毒株 鸽源NDV广西分离株GX1、GX2、GX3、GX4、GX6、GX7、GX13和GX16均由本实验室分离鉴定和保存。1.2 试剂 RNA抽提试剂盒为AXYGEN公司产品；反转录酶(M-MLV)、RNA酶抑制剂为Invitrogen公司产品；DNA Marker DL-2 000为TaKaRa公司产品；ExTaq为宝生物工程(大连)有限公司产品，其他试剂均为分析纯。1.3 引物设计与合成 NDVHN基因扩增引物为参考孙敏华[6]等(2010)所设计的引物，由Invitrogen公司合成。扩增片段大小为2 265 bp。

1.4 8株鸽源NDV广西分离株的增殖和病毒总RNA的制备 将8株鸽源NDV分别接种9日龄SPF鸡胚，37 ℃孵育24 h～96 h后收取尿囊液。尿囊液反复冻融3次，6 000r/min离心10 min后取上清，按AXYGEN公司的AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒操作说明书提取病毒总RNA，-20℃保存备用。

1.5HN基因RT-PCR扩增及测序 提取的RNA反转录反应体系和反应条件：RNA模版14.5 μL，5×RT Buffer 5 μL，DTT 2.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L)1 μL，随机引物(Random 6mers)(25 μmol/L) 1 μL，RNase Inhibitor(10 U/μL) 0.5 μL，M-MLV 0.5 μL，37 ℃孵育60 min。

HN基因扩增PCR反应体系和反应条件：RT产物 2.5 μL，10×ExtaqBuffer 2.5 μL，F1(25 μmol/L)、F2(25 μmol/L)各1.0 μL，dNTP 1 μL，ExTaq0.125 μL ddH2O 17 μL。反应条件为：94 ℃、5 min，94 ℃、45 s，50 ℃、1 min，72 ℃、2.5 min，36个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，将特异性扩增产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。1.6 序列分析和进化树分析 应用DNAStar和MEGA5.05软件，将测序获得的8株鸽源NDVHN基因序列与GenBank 上已公布的国内外NDV 代表毒株的HN基因序列进行比对分析，并绘制系统进化树。

2 结果与分析

2.1 鸽源NDVHN基因的PCR扩增和序列测定结果 运用RT-PCR对8株分离株进行HN基因的扩增，均扩增出与预期大小相一致的目的片段，约2 265 bp，电泳结果见图1。8株鸽源NDV广西分离株HN基因的ORF全长均为1 716 bp，编码571个氨基酸。

图1 分离株HN基因扩增结果

1：Marker DL-2 000； 2～9：GX1、GX2、GX3、GX4、GX6、GX7、GX13、GX16

2.2 鸽源NDVHN基因序列的比较分析及系统进化树 运用DNAStar软件将测序正确的8株鸽源NDVHN基因序列与GenBank上已发表的国内外NDVHN基因代表株参考序列进行比较分析。结果显示，获得的8株鸽源NDV广西流行毒株HN基因之间的核苷酸序列同源性为93.5%～99.9%(其中GX3与GX7的核苷酸序列同源性为93.5%，GX4和GX7的核苷酸同源性为99.9%)，所推导的氨基酸序列同源性为94.8%～99.7%(其中GX1与GX7的同源性最低，为94.8%；GX4和GX7的氨基酸序列同源性最高为99.7%)。与国内外NDVclassⅡ参考毒株的核苷酸同源性为80.2%～99.5%，氨基酸同源性为86.2%～99.8%；其中与NDV基因Ⅵ型的同源性较高，为90.4%～99.5%；与其他基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ型毒株的同源性在81.3%～89.2%之间。与NDVclassⅠ参考毒株、强毒株F48E9、Ⅰ型疫苗株V4、I-2、Ⅱ型疫苗株LaSota和B1的核苷酸同源性分别为66.9%～68.3%，82.7%～84.6%、82.2%～83.9%和81.9%～83.2%、80.2%～82.0%和80.5%～82.0%；氨基酸同源性分别为81.3%～83.0%、88.5%～89.2%、88.5%～89.9%和86.7%～87.9%、86.9%～88.1%和86.9%～87.9%。

运用MEGA5.05软件绘制HN基因系统发育树，结果表明8株鸽源NDV广西分离毒株同处于一个大的进化树分支上，与classⅡ基因Ⅵb亚型毒株如2011年比利时分离株11等在同一大分支上，但相互之间又分属于不同的小进化树分支上。8株鸽源NDV广西分离毒株与我国2011-2013年广西、广东、吉林、辽宁、云南、黑龙江等地鸽源NDV分离株的遗传关系较为接近。而与我国经典强毒株NDV F48E9、Ⅰ型疫苗株V4和I-2、Ⅱ型疫苗株LaSota和B1的遗传距离较远(见图2)。

3 讨论

HN基因中有一个长的开放阅读框，由于终止密码位置的差异,其翻译的多肽链长短不同,据此NDV可分为3个群：A群，ORF全长为1 851 bp，编码616个氨基酸，为非活性多肽前体(HN0)，需要经过水解才能转化成为有生物活性的HN蛋白，该蛋白只存在与无致病性的NDV弱毒株中；B群，ORF全长为1 734 bp，编码577个氨基酸，为具有生物活性的蛋白，存在于无致病性和致病性的NDV毒株中；C群，ORF全长为1 716 bp，编码571个氨基酸，该蛋白也具有生物活性，但仅存在于致病性的NDV强毒株中[7]。本研究成功扩增出8株鸽源NDV广西分离毒株HN基因的核苷酸序列，并展开对HN基因的测序分析研究。经测定8株鸽源NDV广西分离毒株的HN基因ORF均为 1 716 bp，编码 571 个氨基酸，属于强毒的 C 群，符合NDV强毒株的基因长度特征，与用NDV F0裂解位点来判断其为强弱毒株的结果一致[8]。

8株鸽源NDV广西分离毒株HN基因与国内外NDV标准毒株及弱毒株的HN基因比较，核苷酸和氨基酸同源性分别在80.2%～84.6%和 86.7%～89.9%之间，结果表明，8株鸽源NDV广西分离毒株均已发生一定的变异。从系统进化树上可以看出，本次分离鉴定的毒株与我国2011-2013年广西、广东、吉林、辽宁、云南、黑龙江等地鸽源NDV分离株的遗传关系较为接近，属于同一个基因群，表明近年来我国鸽群中流行的鸽源NDV毒株较相近，分离自我国不同地区的鸽源NDV毒株并没有明显的地域差异性。根据对HN基因的遗传进化分析结果，初步推测8株鸽源NDV广西分离毒株应属于classⅡ基因Ⅵb亚型NDV。对于8株鸽源NDV广西分离毒株与其他地区鸽源NDV分离株的深层次相关性有待进一步研究。

图2 8株鸽源NDV广西分离株与国内外41个NDV毒株HN基因系统进化树▲：分离； ◆：疫苗株； ●：强毒株F48E9

目前我国ND的流行与世界上的流行趋势相一致，即同一地区存在不同的基因型，危害家禽的以基因Ⅶ型为主，而危害鸽子的以基因Ⅵ型为主，并且不同基因型在不同地区循环发生，目前鸽群免疫用疫苗株主要为NDV基因Ⅰ型疫苗株V4和基因Ⅱ型疫苗株LaSota，与流行毒株基因型及抗原性均有较大差异，免疫后不一定能够提供100%的完全保护，导致免疫失败，鸽ND发病率仍居高不下[9]。因此，迫切需要研制出含有基因Ⅵ型的鸽源NDV毒株的有效的鸽群专用的优质疫苗。本文对 8株鸽源NDV广西分离株HN基因的克隆和序列的测定，为掌握鸽源NDV广西流行毒株病原学特性、分子流行病学和毒株的遗传变异情况提供了初步材料，对于有效防控鸽ND的发生或者降低其对鸡ND的发生和流行的危害均具有参考借鉴意义。

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Genetic evolution analysis ofHNgene segments of eight pigeon NDVstrains isolated in Guangxi

LU Bing-xia, LIANG Jia-xing, DUAN Qun-peng, CHEN Zhong-wei, JIANG Dong-fu, LU Jing-zhuan,ZHOU Ying-ning, BI Bing-fen, HE Ying, QIN Yi-bin, LI Bin, SU Qian-lian, ZHAO Wu

(Guangxi Veterinary Research InstituteGuangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Nanning 530001, China)

TheHNgene of eight NDV strains isolated from Guangxi different pigeon farms,were amplified by RT-PCR method,sequenced and analyzed. The aim of this study is to explore the molecular evolution characteristics of Guangxi pigeon NDVHNgene,and to provide the basis for scientific prevention and control of Pigeon Newcastle disease. The results showed that the nucleotide sequence length ofHNgene of the eight NDV isolates was 1716 bp,encoding 571 amino acids. They belonged to the virulent C group,and the gene length characteristic ofHNgene of the eight NDV isolates was in accord with the virulent strain.The analysis of nucleotide homologies indicated that the eight NDV isolates shared higher homology with genotype Ⅵb,ranging from 90.4% to 99.5%.The phylogenetic tree analysis demonstrated that the genetic relationship between the eight guangxi NDV strains and the isolates from Guangxi,Guangdong,Jilin,Liaoning,Yunnan,and Heilongjiang from 2011 to 2013 was close. They were located in the same cladogram branch. We assume that the eight pigeon NDV isolates isolated in Guangxi all belong to the gene class Ⅱ genotype Ⅵb NDV.

pigeon ; Newcastle disease virus ;HNgene ; Phylogenetic analysi

ZHAO Wu

2016-10-19

广西兽医生物技术重点实验室系统性研究课题(14-045-31-A-5)；广西兽医研究所基本科研业务费专项(桂科专项2016-2)

卢冰霞(1986- )，女，助理研究员，硕士，主要从事动物病毒学研究，E-mail：lubingxia13@163.com

，赵武，E-mail：zhaowu168866@163.com

S855.3

A

0529-6005(2017)02-0019-04