吴凯朝，邓智年，魏源文，徐林，曹辉庆，蒋胜理，黄诚梅*

（1.广西农业科学院甘蔗研究所/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室/广西甘蔗遗传改良重点实验室，南宁530007；2.广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，南宁530007）

割手密GX83-10愈伤组织诱导与成苗技术

吴凯朝1，邓智年1，魏源文2，徐林1，曹辉庆2，蒋胜理2，黄诚梅2*

（1.广西农业科学院甘蔗研究所/农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室/广西甘蔗遗传改良重点实验室，南宁530007；2.广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，南宁530007）

以割手密GX83-10嫩叶鞘为材料，从愈伤组织诱导、继代、分化，分化苗增殖壮苗、生根等方面，探讨了割手密嫩叶鞘愈伤组织诱导与成苗技术，为开展割手密抗逆基因的功能鉴定研究提供技术参考。

割手密；愈伤组织诱导；成苗

割手密（Saccharum spontaneum L.）别名甜根子草、细茎野生种，禾本科甘蔗属多年生草本植物，具有抗逆性强、适应性广、分蘖多等优良特性，是最具有育种价值的甘蔗野生种质资源，已被广泛应用于甘蔗杂交育种。当前所有种植的甘蔗栽培品种几乎都含有割手密的血缘，这些栽培品种中约10%的染色体来自割手密。近年来甘蔗育种家从形态标记学、细胞学标记、蛋白质标记、多种DNA分子标记（SSR、AFLP、ISSR、RAPD、SCoT）对甘蔗和割手密种质资源进行遗传多样性分析和分类，进而揭示了我国当前甘蔗栽培品种遗传背景狭窄[1-6]，同时表明割手密在未来的甘蔗杂交育种中的应用价值更显突出和重要。目前，有关割手密的组培技术研究仍较少[7]，其研究主要是利用组培诱变筛选变异割手密植株，以期获得更丰富的割手密种质应用于甘蔗育种，但针对割手密的组织培养技术研究、割手密中抗逆性相关基因分离、功能鉴定及遗传转化的研究尚未见报道。随着分子生物学技术迅速发展，通过转基因技术获得新品种是甘蔗遗传改良新手段，特别是通过转基因技术把割手密中抗逆优良基因转移到甘蔗栽培种是当前研究的新方向，因此，通过超量表达与RNAi表达技术开展割手密抗逆优良基因鉴定尤为重要。这就要求割手密的愈伤组织诱导与成苗技术进一步提高和完善，为割手密抗逆优良基因的功能鉴定研究提供必要的前提基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料

广西甘蔗野生种质资源圃保育的割手密GX83-10。

1.2 实验方法

实验方法以本课题组甘蔗组培技术为参考[8-9]，建立割手密愈伤组织诱导与成苗技术。

1.2.1 外植体准备采集割手密GX83-10梢头幼嫩部分，用70%酒精按常规表面消毒杀菌后，剥除外部叶鞘，留下直径0.3 cm左右的心叶，横切成大约0.5 cm×0.3 cm的小切片，用作外植体。

1.2.2 培养方法与培养基愈伤组织诱导培养：将外植体接种于愈伤组织诱导培养基中，每瓶5～6个外植体。愈伤组织诱导培养基：MS+2，4-D 3.0 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7.0 g/L，pH 6.0。

愈伤组织继代培养：接种外植体18 d后将愈伤组织转入愈伤组织继代培养基中，每瓶3～4块愈伤组织。愈伤组织继代培养基：MS+2，4-D 1.0mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7.0 g/L，pH6.0。

愈伤组织分化培养：愈伤组织继代培养15～20 d后，将生长良好的胚性愈伤组织转入愈伤组织分化培养基。愈伤组织分化培养基：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7.0 g/L，pH 6.0。

分化苗增殖壮苗培养：将分化培养出来的割手密分化苗分切成每丛2~3株，转接到增殖壮苗培养基中，增殖代数3～4代。增殖壮苗培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0 g/L，pH 6.0。

分化苗生根培养：将增殖壮苗培养获得的割手密小苗分成5~6株/丛，转接到生根培养基中进行生根培养。生根培养基：1/2 MS+NAA 4.0 mg/L+蔗糖30 g/L，pH 6.0。

1.2.3 培养方式上述外植体准备和接种、转接实验必须在超净工作台完成。愈伤组织诱导培养和继代培养的培养条件为：暗培养15～20 d，温度28±2℃；愈伤组织分化培养、分化苗增殖壮苗培养、分化苗生根培养的培养条件均为：光照培养20～25 d，光照14 h，光照度为1500～2000 lx，温度28±2℃。

2 实验结果

2.1 割手密GX83-10愈伤组织诱导与继代

用本课题组的愈伤组织诱导培养基，共接种割手密GX83-10嫩叶鞘外植体258个，经过9d暗诱导培养之后，共获得128块黄色的愈伤组织（图1），诱导率为49.6%，愈伤褐化数56个，愈伤发生褐化率为43.8%。挑选出较好的愈伤组织转接到愈伤组织继代培养基进行继代培养，以诱导出淡黄色颗粒胚性愈伤组织。

2.2 割手密GX83-10愈伤组织分化

挑选经过继代培养后愈伤组织177块在分化培养基上进行光照培养，分化培养7d后，有65块愈伤分化块，其表面分化出绿色点苗状组织，15～20d后开始成苗（图2），分化率为36.7%。从图2也可以看出，割手密愈伤组织分化成苗受到褐化的影响较大，降低了分化率。

图1 割手密愈伤组织诱导

图2 割手密愈伤组织分化

2.3 割手密GX83-10分化苗增殖壮苗

待抗性苗长至2 cm时，将丛芽剥离成单苗或2～3苗/丛进行壮苗培养。从表1可以得出，从纤细、矮小的割手密分化苗到获得较壮的割手密化分苗(图3、图4、图5），需经过3代增殖壮苗培养，每代培养时间20 d左右。经过3代增殖壮苗培养，总增殖系为21.04。

表1 割手密GX83-10分化苗增殖壮苗

图3 分化苗增殖第一代

图4 分化苗增殖第二代

图5 分化苗增殖第三代

图6 割手密分化苗生根

2.4 割手密GX83-10分化苗生根

增殖壮苗培养后的割手密分化苗接种到生根培养基，经过10d的培养，分化苗长出根点，根系逐渐发育完整、粗壮，植株长势良好，发根率可达到100%(表4）。苗生根量多，主根粗长发达，侧根多，表明获得的割手密组培苗较为理想(图6）。

3 小结与讨论

本研究中，采用嫩叶为外植体的割手密愈伤组织诱导与成苗技术能较好地实现高效的繁殖率，获得壮实的割手密组培苗，为进一步开展割手密抗逆优良基因的功能鉴定研究提供技术支撑。本实验中，发现外植体褐化是影响割手密GX83-10愈伤组织分化成苗的主要原因之一。为了防止褐化，提高分化成苗率，在接种前，将外植体置于含有50 mg/L柠檬酸的无菌水浸泡8～10 min，可以减轻外植体褐化。在愈伤诱导、继代、分化，分化苗增殖、生根等培养基中，均加入适量浓度（30～60 mg/L）的柠檬酸，可以有效地减轻褐化程度。同时，根据褐化情况，及时将外植体转移至新鲜的培养基中，也可以减少褐化。

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Embryogenic Callus Induction and Plantlets Growing Technology of Saccharum spontaneum L.

WU Kai-cao1,DENG Zhi-nian1,WEI Yuan-wen2,XU Lin1,CAO Hui-qing2, JIANG Sheng-li2,HUANG Cheng-mei2*
(1.Sugarcane Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement(Guangxi),China Ministry of Agriculture/Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Nanning 530007; 2.Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab,Nanning 530007)

In the experiment,tender leaf sheath of Saccharum spontaneum L.(GX83-10)was cultured in vivo to study embryogenic callus induction,subculture and differentiation,the regenerated plantlets growing and rooting. The technology of embryogenic callus induction and plantlets growing of Saccharum spontaneum L.was established and optimized,which provide reference for its identification of stress resistance gene function.

Saccharum spontaneum L.;embryogenic callus induction;plantlets growing

S566.103

A

1007－2624（2017）02－0009－03

10.13570/j.cnki.scc.2017.02.003

2016-12-21

国家自然科学基金项目（31400281）；广西自然科学基金面上项目（2014GXNSFAA118128）；广西农业科学院基本业务专项（2015JZ11、2015YT96）。

吴凯朝（1979-），副研究员，主要从事甘蔗分子遗传育种研究工作，E-mail：kaichaowu@126.com。

黄诚梅（1977-），女，广西上思人，副研究员，研究方向：甘蔗栽培与分子生物学，E-mail：huangchengmei@gxaas.net。