王晓平

(广东医学院附属佛山禅城医院，广东 佛山 528000)

Nexilin基因多态性与冠状动脉病变程度的关系及机制

王晓平

(广东医学院附属佛山禅城医院，广东 佛山 528000)

目的 研究Nexilin基因多态性与冠状动脉病变程度的相关性及可能机制。方法 胸痛患者573例，依据冠脉造影结果分为冠心病组344例，正常对照组229例。采用DNA序列测定技术，检测两组研究对象Nexilin基因外显子及外显子/内含子连接区的核苷酸序列。使用测序软件与GenBank数据库相关基因序列比对，对SNP位点进行序列分析。根据Gensini评分对冠脉病变程度进行评分，分析Nexilin位点多态性与冠脉病变程度的关系。结果 通过Nexilin基因外显子SNP位点的序列分析，共发现2个SNP位点，其中1个为基因库中收录的rs1167781位点，另一个是新发现位点。对rs1167781位点G/A错义突变进行分析，发现冠心病组患者携带A等位基因的频率明显低于正常对照组(P<0.01)。A等位基因频率数量随着Gensini评分增加呈明显下降趋势(P<0.05)。以Gensini评分为终点事件，Logistic回归分析显示rs1167781位点突变型和冠脉病变严重程度独立相关。结论 Nexilin基因rs1167781位点多态性与冠心病患者冠状动脉病变程度存在明显相关性，为冠心病的保护因素。

Nexilin；单核苷酸多态性；冠状动脉疾病

Nexilin基因是一个在心脏、动脉及静脉中特异性表达的新基因。相关研究显示，大鼠心肌缺血预适应组的左心室组织Nexilin基因比正常对照组上升3.2倍〔1〕，提示Nexilin是一个心肌缺血预适应启动的潜在候选基因。冠状动脉病变主要的病理生理基础是动脉粥样硬化，在多种作用因素中血脂异常和炎症机制发挥重要作用〔2〕。本研究对Nexilin基因外显子、外显子/内含子连接区进行序列扫描分析，探讨 Nexilin基因多态性与血脂及冠状动脉病变程度的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年1月至2015年6月因新发胸痛来本院就诊的患者573例。筛选标准：①汉族患者，入院后同意留取血清标本监测血脂基因，接受冠脉造影术；②排除有严重肝肾功能不全，既往接受支架植入术，存在家族遗传性高脂血症患者。依据冠脉造影结果分为冠心病组(1支及以上主要冠状动脉狭窄>50%)344例，正常对照组229例。冠心病组中男283例，女61例；年龄56～81岁，平均(65.91±9.53)岁；长期吸烟史103例(29.94%)、高血压史195例(56.69%)、糖尿病史132例(38.37%)。正常对照组中男110例，女119例；年龄54～85岁，平均(64.17±11.08)岁；长期吸烟史42例(18.34%)、高血压史125例(54.59%)、糖尿病史37例(16.16%)。两组患者平均年龄、高血压史均无统计学差异(P>0.05)；冠心病组中男性患者、长期吸烟史、糖尿病史比例明显高于正常对照组(P<0.05)。

1.2 方法

1.2.1 Nexilin目的基因提取 入院后次日清晨采集患者空腹肘静脉血3 ml，置于抗凝管中混匀，取其中1 ml立即进行基因组DNA提取，余下的2 ml置于-80℃冰箱中保存备用。将血液加入1.5 ml离心管中加入900 μl红细胞裂解液、150 μl血细胞，混匀后静置10 min；4℃、 12 000 r/min离心10 min，静置5 min后弃去上清；加300 μl细胞裂解液，震荡30 s后37℃水浴至透明，加150 μl蛋白沉淀液，震荡摇匀后以4℃、 12 000 r/min离心1 min。取1.5 ml离心管，加入400 μl异丙醇，再加以上处理得到的上清液，混匀至成絮状物，4℃、12 000 r/min离心1 min，弃去上清，加400 μl 75%乙醇，混匀，4℃、 12 000 r/min离心1 min，弃去上清，空气干燥10 min；加100 μl DNA水合物，混匀后65℃水浴10 min，室温条件下静置24 h，检测浓度后置于-80℃冰箱中冻存。

1.2.2 Nexilin基因扩增与测序 PCR法扩增Nexilin基因DNA 433碱基5′末端片段，反应体系50 μl，包括无菌蒸馏水32 μl，Buffer 10 μl，dNTPs(2 mmol/L)5 μl，MgSO4(25 mmol/L)5 μl，引物(10 mmol/L)1.5 μl，cDNA 1 μl，PCR酶1 μl；反应程序采用常规两步法，共25个循环，引物由上海闪晶分子生物科技有限公司合成。使用310型全自动DNA测序仪对上述获得的PCR扩增产物进行反向测序：对扩增得到的PCR产物进行电泳和PCR法测序，乙醇法除去PCR产物中的杂质。

1.3 统计学分析 使用SPSS15.0软件行t检验、χ2检验、Logistic回归分析。

2 结 果

2.1 Nexilin目的基因片段PCR扩增结果 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳显示第7、8号外显子扩增片段约为552 bp；第9号外显子扩增片段约为458 bp；第11号扩增片段约为443 bp，与预期分子量符合。见图1。

2.2 Nexilin目的基因片段测序结果 对7、8、9、11号4个外显子进行测序分析，最终测出2个SNP位点。1个为基因库中的rs1167781位点，为Nexilin基因第8个外显子区G/A错义突变，是该基因cDNA序列的1030碱基，密码子由GGA→AGA，见图2。新发现1个位点，第9外显子区A/G错义突变为1195A/G，密码子由AAA→GAA，见图3。

1 DNA标准带；2、3为第11外显子片段；4、5为第9外显子片段；6、7为第7、8外显子片段图1 目的基因片段电泳图谱

a野生纯合子；b杂合子；c突变纯合子；箭头为SNP位点图2 rs1167781 SNP位点测序结果

a野生纯合子；b杂合子；箭头为SNP位点图3 第9外显子1195A/G位点测序结果

2.3 两组Nexilin 基因rs1167781位点基因型和等位基因频率比较 冠心病组患者携带A等位基因的频率明显低于正常对照组(P<0.01)。见表1。

表1 两组患者rs1167781位点基因测序比较〔n(%)〕

2.4 rs1167781位点等位基因频率与冠脉病变程度的关系 A等位基因频率数量随着Gensini评分增加呈明显下降趋势(χ2=9.503，P<0.05)。见表2。

2.5 rs1167781位点多态性与冠脉病变程度多因素分析 以Gensini评分为终点事件，Logistic回归分析显示，rs1167781位点的突变型和冠脉病变严重程度独立相关。调整性别、长期吸烟史、糖尿病史、各血脂指标后，rs1167781位点变异仍独立相关。见表3。

表2 不同冠脉病变程度患者rs1167781位点等位 基因频率〔n(%)〕

表3 rs1167781位点多态性与冠脉病变程度的 多因素Logistic回归分析

3 讨 论

Nexilin作为一个新的肌动蛋白结合蛋白其基因功能目前尚未明确，最新研究显示Nexilin可诱导细胞黏附和迁移，在细胞肥大及心肌缺血预适应模型中表达水平明显提升〔3〕，说明该基因可在心脏多种病理改变过程中发挥作用。本次研究针对心肌组织特异性表达的Nexilin基因，其结构包括基因库中nexn基因的第7～12外显子，在第8、9、11外显子区域内存在4个错义SNP。因第7个内含子只有102个碱基，因此本次研究将第7、8外显子作为一个片段进行扩增与测序。

通过对7、8、9、11号4个外显子SNP位点进行序列分析，最终发现2个SNP位点。在第8外显子区G/A错义突变，正好处在基因的一个核定位信号区域，推测其对该基因功能造成一定影响。通过对本地区汉族人该位点的分析，结果显示冠心病组患者携带A等位基因的频率明显低于正常对照组。

本次研究对冠脉病变程度与rs116778位点多态性关系分析说明rs1167781位点突变型是冠状动脉病变的保护因素。可能原因为rs1167781基因启动子区域的第8个碱基发生突变(G置换A)，进而破坏了MspI限制性内切酶识别位点，产生的突变型可能影响基因的转录及表达，缓解心肌细胞缺血缺氧损伤〔4〕，同时还可降低心肌细胞的炎症反应〔5〕。

1 Shibata N，Nagata T，Shinagawa S，etal.Genetic association between APOA1 and APOD polymorphisms and Alzheimer's disease in a Japanese population〔J〕.J Neural Transm，2013；120(11)：1599-603.

2 Dawar R，Gurtoo A，Singh R.Apolipoprotein A1 gene polymorphism(G-75 Aand C+83T) in patients with myocardial infarction：a pilot study in a North Indian population〔J〕.Am J Clin Pathol，2010；134：249-55.

3 Rai TS，Khullar M，Sehrawat BS，etal.Synergistic effect between apolipoprotein E and apolipoprotein A1 gene polymorphisms in the risk for coronary artery disease〔J〕.Mol Cell Biochem，2008；313：139-46.

4 Mirguet O，Lamotte Y，Donche F，etal.From ApoA1 upregulation to BET family bromodomain inhibition：discovery of I-BET151〔J〕.Bioorg Med Chem Lett，2012；22(8)：2963-7.

5 Bandarian F，Hedayati M，Daneshpour MS，etal.Genetic polymorphisms in the APOA1 gene and their relationship with serum HDL cholesterol levels〔J〕.Lipids，2013；48(12)：1207-16.

〔2016-05-09修回〕

(编辑 郭 菁)

王晓平(1960-)，女，副主任医师，主要从事老年冠状动脉病变研究。

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1005-9202(2017)04-0812-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.012