王 姝 辽宁省绥中县动物检疫站 125200

绵羊痘的血清学检疫

王 姝 辽宁省绥中县动物检疫站 125200

应用琼脂免疫扩散试验、血凝抑制试验和中和试验等均有助于绵羊的检疫。但是痘病毒的感染性在中和试验中常不完全消失。对病羊取发痘初期和治愈时的血清进行中和试验，也有较高的现症诊断价值。

1 血凝抑制试验

（1）材料准备与配制。（1）稀释液按常规配制0.85%生理盐水和0.4%枸橼酸钠生理盐水，经718Pa（15磅）高压灭菌。选择其红细胞能为痘病毒凝集的健康公鸡，从翅静脉采血，与上述抗凝剂混合后，按常规方法用生理盐水洗涤并制成1%鸡红细胞悬液。取11～12日龄的SPF鸡胚，经绒毛尿囊膜接种痘病毒，剂量为0.2mL/胚。用石蜡封口，置于35～36℃温箱中培养72～96小时，取有痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜，剪碎并加玻璃砂和少量生理盐水充分研磨，再加生理盐水制成1:5的悬液，冻融1次，以3000装/分钟离心20分钟，取上清液作为血凝素。挑选体重1kg左右的家兔若干只按如下程序进行免疫，每周免疫1次，共计3次，而后放血分离血清。第一次用画线法进行接种，接种部位为家兔背侧壁中上部皮肤。先去毛（拔毛或剃毛），再用75%酒精消毒，然后用针作棋盘状划痕，尽量避免出血，划痕处涂上0.1mL的痘病毒。以不同的痘病毒（如牛痘病毒、绵羊痘病毒、鸡痘病毒、猪痘病毒等）各接种2～3只家兔，待病毒液自然阴干后将家兔放回笼中。第二次用皮下注射法接种，每只家兔接种与第一次免疫相同的病毒液，剂量为0.2mL／只。第三次用静脉注射法接种，每只家兔接种与第一次、第二次免疫相同的病毒液，剂量为0.2mL／只。10天后采血分离血清，测定抗体的效价。

（2）血凝素效价测定。血清的处理置56℃水浴箱中灭活30分钟。采用微量血凝板滴定血凝素方法，除第一孔加0.4mL生理盐水外，其余各孔均加生理盐水0.1mL。第一孔加0.1mL血凝素成为1:5稀释的血凝素，自第1孔取0.1mL加入第2孔中混匀后再取0.1mL，向后做等量倍比稀释，最后一孔混合后弃去0.1mL。每孔加生理盐水0.1mL，放入37℃恒温箱中1小时。各孔加1%鸡红细胞悬液0.1mL，最后每孔总量均为0.3mL。再放入37℃恒温箱中30分钟，判定结果。

以能引起红细胞完全凝集的病毒最高稀释度作为一个红细胞凝集单位，按血凝素滴定结果将血凝素稀释成4单位／0.1mL，即为工作浓度血凝素。

（3）试验方法。从第2孔起，每孔加生理盐水0.1mL至第10孔，共计9孔。第1、2、10孔各加1:5灭活的被检血清0.1mL（第10孔作血清对照用）。从第2孔开始，将被检血清作倍比稀释，至第9孔，混合后弃去0.1mL。从第1孔开始至第9孔为止，每孔加工作浓度的血凝素0.1mL。振摇均匀，将微量血凝板放入37℃恒温箱中30分钟。每孔加1%鸡红细胞悬液0.1mL。振摇均匀，将微量血凝板放入37℃恒温箱中30分钟。判定结果，以血清中最大稀释度无凝集现象的作为血凝抑制试验的效价，血清对照应无凝集现象。工作浓度血凝素对照孔应呈完全凝集。

（4）结果判定。按血清稀释度计算，以完全抑制血凝的终点稀释度为其效价。1:10以上判为阳性反应。

2 琼脂免疫扩散试验

（1）材料准备。抗原和标准阳性血清均由指定单位供应，按说明书使用。被检血清无细菌污染，保存于4℃。器材为直径90纳米的平皿、微量移液器及微量滴头、三角烧瓶、打孔器和水浴箱等。琼脂糖板制备称取琼脂糖1g于三角瓶中，加100mL生理盐水，按1∶10000比例加入叠氮钠或硫柳汞，热溶化后倒入平皿，每平皿约16mL（厚度约为2.5mL）凝固后置冰箱4℃保存备用。

（2）操作方法。用打孔器在琼脂糖板上打孔，孔径5mm、孔距3mm。中心孔滴加抗原，第 1、3、5 孔加被检血清，第 2、4、6 孔加标准阳性血清，每孔均加50微升。加样完毕静止10分钟，放入湿盒置37℃，待24～48小时后判定结果。

（3）结果判定。将琼脂糖板置于暗背景下观察，标准阳性血清和抗原孔之间应出现一条清晰、致密的沉淀线，则试验可以成立。被检血清孔和中心抗原孔中间出现清晰、致密的沉淀线，并且与标准阳性血清的沉淀线环联，判为阳性（＋）；反之判为阴性（－）。