戴珍珍 陈凯英 朱红贤 钟国平 顾昕

Ang- 2 及Tie- 2 在宫颈癌组织中的表达及临床意义

戴珍珍 陈凯英 朱红贤 钟国平 顾昕

目的探讨血管生成素-2（Ang-2）及其受体内皮细胞特异性酪氨酸激酶受体（Tie-2）在宫颈癌组织中发生、发展和临床病理学特征的关系。方法采用免疫组织化学、RT-PCR及Western blot分别检测Ang-2及Tie-2在60例正常宫颈及宫颈癌组织中的组织定位、基因差异表达及蛋白差异表达；采用Spearman法分析Ang-2及Tie-2的表达相关性。结果宫颈癌组织中Ang-2及Tie-2的阳性表达率明显高于正常宫颈组织，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。Ang-2及Tie-2在淋巴结发生转移或临床分期Ⅲ～Ⅳ级的患者中的表达明显高于未发生淋巴结转移或临床分期Ⅰ～Ⅱ级的患者（均P＜0.05）。宫颈癌组织中Ang-2及Tie-2 mRNA及蛋白表达水平均明显高于正常宫颈组织，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。Tie-2与Ang-2在宫颈癌组织中的表达呈正相关(r=0.847 9，P＜0.01)。结论Ang-2及Tie-2的表达水平与宫颈癌临床分期和有无淋巴结转移密切相关，且Ang-2、Tie-2 mRNA及蛋白在宫颈癌组织中的表达明显高于正常宫颈组织，Ang-2及Tie-2可能在宫颈癌发生、发展过程中发挥重要作用。

血管生成素-2 受体 Tie-2 宫颈肿瘤

子宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，严重威胁广大妇女的健康[1]。迄今为止，肿瘤新生血管学说是目前公认的宫颈癌发病机制之一。血管生成素（angiopoietin，Ang）是一种与血管生成密切相关的蛋白质，在肿瘤形成过程中对血管形成、稳定、转移和退化起重要作用。其中血管生成素-2（Ang-2）和它们的共同受体内皮细胞特异性酪氨酸激酶受体（Tie-2）与血管生成密切相关[2-3]。本研究应用免疫组织化学、RT-PCR及Western blot法检测宫颈癌组织中Ang-2及其受体Tie-2的表达情况，进一步探讨Ang-2及其受体Tie-2表达与宫颈癌组织发生、发展及与临床病理学特征的关系，以期用于解释宫颈癌的发病机制，探索潜在的干预措施。

1 对象和方法

1.1 对象选取2008至2015年本院收治的宫颈癌患者60例作为实验组，患者年龄35～51（43±5.02）岁；根据2009年宫颈癌FIGO分期[4]，Ⅰa期4例，Ⅰb期8例，Ⅱa期12例，Ⅱb期14例，Ⅲ～Ⅳ期22例；按WHO病理组织学分型：鳞状细胞癌46例，腺癌14例；按淋巴结转移：淋巴结转移16例，无淋巴结转移44例；按病理分化程度：高分化18例，中分化28例，低分化14例。同时选取妇产科因子宫肌瘤等良性疾病行子宫完全切除术，且病理检查证实无其他宫颈疾病妇女的正常宫颈上皮组织60例作为对照组，患者年龄37～49（41.25±4.83）岁。纳入标准：（1）宫颈癌的诊断、临床分期及病理分型均符合《2012NCCN子宫肿瘤临床实践指南（第2版）》[5]中的标准；（2）全部患者进行宫颈部位病理取材前均未施行放化疗及生物、免疫治疗；（3）本研究获医院伦理委员会批准和患者知情同意。

1.2 主要仪器及试剂全自动免疫组化染色仪为德国Leica公司Bond-Max型；实时定量PCR仪为美国ABI公司7500型；蛋白印迹电泳设备为美国Bio-Rad公司Mini-PROTEANRTetra型。兔抗人多克隆抗体Ang-2、Tie-2均购自英国abcam公司，工作浓度分别为1∶200、1∶100；EnVision试剂盒（批号：1510130015）购自福建迈新生物技术有限公司；Ang-2、Tie-2引物由北京奥康生物技术公司设计；RT-PCR一步法反转录试剂盒（批号：210212）购自德国Qiagen公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学收集相应病例的存档蜡块，行4μm连续切片，取1张行HE染色，其余行免疫组化EnVision法检测。实验步骤：（1）组织石蜡切片4μm，65℃烤片过夜；（2）脱蜡直至水化；（3）3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶10min；（4）PBS每次冲洗2min，3遍；（5）抗原热修复，EDTA pH=9.0加温20min；（6）重复步骤（4），3遍；（7）室温下羊血清工作液封闭10min；（8）一抗室温孵育60min；（9）重复步骤（4）；（10）即用型广谱二抗室温孵育25min；（11）重复步骤（4）；（12）即用型DAB显色液显色7min；（13）重复步骤（4）；（14）苏木素复染、蓝化、系列梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固切片。结果判断：阳性颜色呈棕黄色颗粒，主要表达在肿瘤细胞胞质内，随机观察10个高倍镜视野，平均每个高倍镜视野的阳性细胞≥5%，即判断为阳性[6]。

1.3.2 组织基因表达检测采用RT-PCR法检测正常宫颈组织及宫颈癌组织中Ang-2及Tie-2的表达。Trizol一步法提取总RNA，以β-actin作为内参，进行总RNA定量和纯度分析。逆转录反应按照试剂说明书操作。Ang-2的上游引物：5′-CTTATGAGCGAGAATGGG-3′，下游引物：5′-TAGGTTGTTGGGTTGTTT-3′，扩增产物长度181bp；Tie-2的上游引物：5′-AACTTGACTTCGGTGCTA-3′，下游引物：5′-TGAACCTTGTAACGGATAG-3′，扩增产物长度245bp；β-actin的上游引物：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，下游引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′，扩增产物长度250bp。PCR反应条件为：95℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃30s，28个循环。取5μl PCR产物，2.0%琼脂糖/溴化乙锭凝胶电泳。UVP凝胶密度扫描仪及其分析软件（UVP，Inc.）进行半定量分析。

1.3.3 组织蛋白表达检测采用Western blot法取液氮保存的正常或宫颈癌组织，根据质量/体积比1∶6加入尿素裂解液，冰上匀浆处理15s，重复5次，每次间隔10s，冰上裂解1h，4℃14 000×g离心20min，上清液即为组织总蛋白。Bradford法检测蛋白浓度。12%SDSPAGE电泳分离蛋白，半干法转印至PVDF膜（40mA 2h），用含5%脱脂奶粉的TBS室温封闭1h，分别将一抗Ang-2（兔抗1∶200）、Tie-2（兔抗1∶100）和β-actin（兔抗1∶1 000）4℃孵育过夜，二抗（羊抗兔1∶2 000）37℃50min，ECL显影，凝胶成像系统扫描。通过软件测定其灰度值，同一样本的Ang-2/Tie-2与β-actin灰度比值作为该样本Ang-2/Tie-2的相对量，用于统计学分析。

1.4 统计学处理采用SPSS 21.0统计软件；计数资料比较采用χ2检验或校正χ2检验，计量资料比较采用t检验。Tie-2与Ang-2在宫颈癌组织中的表达相关性分析采用Spearman秩相关。

2 结果

2.1 Ang-2及Tie-2在正常宫颈及宫颈癌组织中的表达情况Ang-2及Tie-2阳性颗粒均主要表达于肿瘤细胞的胞质中，见图1。宫颈癌组织中Ang-2及Tie-2的阳性表达率明显高于正常宫颈组织，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表1。Ang-2及Tie-2在淋巴结发生转移或临床分期Ⅲ～Ⅳ级的患者中的表达明显高于未发生淋巴结转移或临床分期Ⅰ～Ⅱ级的患者（均P＜0.05），但与患者年龄、病理组织学分型及肿瘤分化程度无关（均P＞0.05），见表2。

2.2 正常宫颈及宫颈癌组织中Ang-2及Tie-2 mRNA的表达情况宫颈癌组织中Ang-2及Tie-2 mRNA表达水平均明显高于正常宫颈组织，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表3和图2。

2.3 正常宫颈及宫颈癌组织中Ang-2及Tie-2蛋白的表达情况宫颈癌组织中Ang-2及Tie-2蛋白表达水平均明显高于正常宫颈组织，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表4和图3。

图1 Ang-2及Tie-2阳性颗粒均主要表达于肿瘤细胞的胞质中[a：正常宫颈组织中Ang-2（-）；b：宫颈癌组织中Ang-2（+）；c：正常宫颈组织中Tie-2（-）；d：宫颈癌组织中Tie-2（+）；HE染色，×400]

图2 Ang-2及Tie-2 mRNA在正常宫颈及宫颈癌组织中的表达情况

表1 Ang-2及Tie-2在不同宫颈组织中的表达情况[例（%）]

表2 Ang-2及Tie-2的表达及与临床病例特征的关系[例（%）]

表3 正常宫颈及宫颈癌组织中Ang-2及Tie-2 mRNA的表达情况

2.4 Ang-2与Tie-2在宫颈癌组织中的表达相关性Ang-2与Tie-2在宫颈癌组织中的表达呈正相关（r= 0.847 9，P＜0.01），见图4。

图4 Ang-2与Tie-2在宫颈癌组织中的表达相关散点图

3 讨论

肿瘤的增殖和转移依赖于肿瘤血管的生成[6-7]。血管生成是多因素相互作用的结果。肿瘤组织中血管生长因子与抑制因子调节失衡，促生长因子表达相对增高，血管稳定性降低[2]。已发现的血管生长因子包括Ang、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶家族等[8-9]。已有文献报道VEGF参与宫颈癌的血管生成和淋巴管生成，其通过诱导血管形成，调节免疫细胞的活性而促进肿瘤细胞的转移[10-11]，然而关于Ang家族在宫颈癌发病机制中的功能目前尚不明确。

表4 正常宫颈及宫颈癌组织中Ang-2及Tie-2蛋白的表达情况

图3 正常宫颈及宫颈癌组织中Ang-2及Tie-2蛋白的表达情况

Ang家族包括Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4四个异构体。其中Ang-1、Ang-2与血管生成的关系最为密切，生物学功能相反[10]。Ang-1主要维持血管成熟和稳定，不参与肿瘤起始[12]；Ang-2与内皮细胞特有的激酶受体Tie-2结合后不引起后者的磷酸化，离断血管内皮细胞与周围细胞的连接，引起血管的不稳定，参与肿瘤新生血管的形成过程[8,13]。已有研究证实，Ang-2/Tie-2系统对乳腺癌[12]、肺癌[14]等肿瘤血管新生起重要调节作用，然而在宫颈癌发病中尚缺乏系统性的研究。

本研究首先应用免疫组化方法系统性研究Ang-2/Tie-2系统的关键因子Ang-2及Tie-2的表达，进而阐明Ang-2/Tie-2系统在宫颈癌发病中的作用。研究发现Ang-2及Tie-2均表达于正常宫颈及宫颈癌细胞的胞质中，而在宫颈癌组织中的表达明显升高。同时结合患者临床特征进行统计学分析发现，Ang-2及Tie-2的表达与宫颈癌的淋巴结转移和临床分期密切相关，淋巴结发生转移或者临床分期Ⅲ～Ⅳ级的患者Ang-2及Tie-2阳性率明显高于未发生淋巴结转移或临床分级Ⅰ～Ⅱ级的患者，进而说明Ang-2及Tie-2的过度表达易发生盆腔淋巴结转移和肿瘤浸润。然而根据本研究实验数据，目前尚无充分依据证明Ang-2及Tie-2的表达与患者年龄、组织学类型及肿瘤分化程度相关，提示Ang-2/Tie-2系统可能与宫颈癌发病年轻化无明显相关性。进一步应用RT-PCR及Western blot法分别从基因及蛋白水平检测正常宫颈及宫颈癌组织中Ang-2及Tie-2的表达情况，结果提示宫颈癌组织中Ang-2及Tie-2基因和蛋白均显著高表达，且相关性分析发现，两者在宫颈癌组织中的表达呈正相关，高度提示Ang-2及其受体Tie-2可能联合参与了宫颈癌肿瘤血管的发生。

综上所述，本研究结果可初步提示Ang-2及Tie-2与宫颈癌的发生、发展、浸润和转移有关；Ang-2及Tie-2很可能通过影响肿瘤及周围组织血管生成促进宫颈癌的生长。随着分子生物学的发展，我们有望从基因水平阻断Ang-2及Tie-2的表达，这可能将成为治疗宫颈癌的新靶点。

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Expression of Ang-2 and Tie-2 in cervical cancer

DAI Zhenzhen,CHEN Kaiying,ZHU Hongxian,et al.Department of Pathology, Yinzhou People’s Hospital,Ningbo 315040,China

ObjectiveTo investigate the expression of angiopoietin-2(Ang-2)and its receptor Tie-2(Tie-2)in cervical cancer and their clinical significance.MethodsThe protein and mRNA expressions of Ang-2 and Tie-2 in 60 cervical cancer tissue samples and 60 normal cervical tissue samples were detected by immunohistochemical technique,RT-PCR and Western blot,respectively.The association between Ang-2,Tie-2 expression and clinical features was analyzed by Spearman analysis. ResultsAng-2 and Tie-2 were detected in the cytoplasm of cancer cells.The expression of Ang-2 and Tie-2 were significantly higher in cervical cancer tissues than that in normal tissues(all P＜0.05).The expression of Ang-2 and Tie-2 was significantly higher in patients with lymph node metastasis and clinical stage III-IV than that in patients without lymph node metastasis and with clinical state I-II(all P＜0.05).Expression of Ang-2 was positively correlated with expression of Tie-2(r=0.847 9,P＜0.01). ConclusionThe expressions of Ang-2 and Tie-2 are up-regulated in cervical cancer,particularly in late stage cancer with lymph node metastasis,which indicates that Ang-2 and Tie-2 may play an important role in the progress of cervical cancer.

Angiopoietin-2ReceptorTie-2Cervical neoplasm

2016-12-21）

（本文编辑：陈丽）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.4.2016-2166

宁波市鄞州区农业与社会发展领域科技项目

315040宁波市鄞州人民医院病理科（戴珍珍、钟国平、顾昕），妇产科（陈凯英、朱红贤）

陈凯英，E-mail：958025950@qq.com