刘永东 韩建强 张广平李俊峰 张传光 胡强

结缔组织生长因子在肾积水模型大鼠肾组织中的表达研究

刘永东 韩建强 张广平李俊峰 张传光 胡强

目的观测结缔组织生长因子（CTGF）在肾积水模型大鼠肾组织中的表达，并与先天性肾积水患儿进行对比，为先天性肾积水的靶点防治研究提供可靠的动物模型。方法将48只成年健康雄性Wistar大鼠分为模型组和对照组各24只。模型组行左侧肾盂输尿管处游离并结扎输尿管，对照组仅行左侧肾盂输尿管处游离。两组在术后1、2、4、8周各随机选取6只，行肾脏病理学检查，用免疫组织化学染色及Western blot法检测CTGF在组织中的分布及蛋白的表达水平。结果CTGF蛋白含量随着梗阻时间延长而增加。CTGF在模型组肾脏中各时点的表达明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。结论CTGF在大鼠肾积水模型中为阳性表达，且与梗阻时间呈正相关，与前期先天性肾积水患儿的研究结果相一致，此模型可用于先天性肾积水的CTGF靶点防治。

大鼠 肾积水 结蹄组织生长因子

肾盂输尿管连接处梗阻（ureteropelvic junction obstruction，UPJO）所致肾积水可使肾脏发生一系列的生理、病理变化，最终导致肾萎缩并纤维化。动物研究表明，转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）表达是介导间质纤维化过程的关键机制，而结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）是TGF-β1致纤维化作用的下游关键性效应因子，在促进成纤维细胞转分化、合成与分泌胶原蛋白等细胞外基质的过程中发挥重要作用[1]。本研究通过应用免疫组织化学及Western blot法检测CTGF在组织中的分布及蛋白的表达水平，以明确CTGF在肾积水模型大鼠肾组织中的表达，从而为先天性肾积水的靶点防治提供可靠的动物模型。

1 材料和方法

1.1 实验动物成年健康雄性Wistar大鼠48只，体重170～190g，由潍坊医学院动物室提供，常规饲养1周，期间无大鼠死亡。

1.2 试剂及仪器SP免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司）；BCA蛋白质定量测定试剂盒、蛋白裂解液（南京凯基生物科技发展有限公司）；预染蛋白Marke、GAPDH抗体（北京博奥森公司）；即用型SABC免疫组织化学染色试剂盒、兔抗大鼠CTGF多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3 动物分组及模型建立将大鼠分为模型组和对照组各24只。模型组采用3-0丝线结扎制备单侧完全性输尿管梗阻模型，以氯胺酮8mg/kg腹腔注射麻醉，固定备皮消毒，取腹正中切口，找到左侧肾盂输尿管并游离，距肾盂输尿管连接处1cm双重丝线结扎并切断输尿管，随后逐层关闭腹腔；对照组打开腹腔后仅行左侧肾盂输尿管处游离。

1.4 病理学检查两组大鼠在术后1、2、4、8周各随机选取6只，氯胺酮腹腔注射麻醉，固定备皮消毒，取腹正中切口，找到左侧肾脏，取肾脏标本，行肾脏病理学检查。

1.4.1 HE染色将石蜡切片依次脱蜡，梯度乙醇水化，HE染色，梯度乙醇脱水，透明，固封，显微镜下观察肾小球及肾小管间质的变化。

1.4.2 免疫组织化学染色采用SABC法，石蜡标本切片后放恒温箱，取出后二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化；3%过氧化氢阻断内源性过氧化酶；PBS缓冲液处理0.02mol/L柠檬酸微波修复；非免疫性动物血清封闭非特异性抗原；兔抗大鼠CTGF多克隆抗体稀释度为1∶100，4℃孵育过夜；按SP免疫组化试剂盒说明加生物素标记的二抗，孵育30min后加标记过氧化酶的链霉亲和素孵育30min；DAB显色，以PBS代替一抗作为阴性对照。经苏木素轻度复染，脱水，透明，封片处理。同时取先天性肾积水患儿的肾脏标本作阳性对照，显微镜下观察阳性颗粒的分布及表达水平。

1.4.3 Western blot法将两组大鼠肾脏标本尽量剪碎，加入裂解液内30min，然后在4℃下12 000r/min离心5min，提取上清液，BCA法测定蛋白浓度，进行10% SDS-PAGE垂直凝胶电泳，转膜（湿转），兔抗大鼠CTGF多克隆抗体，稀释比例均为1∶2 000，均4℃孵育过夜，TBST洗10min×3次。HRP标记的山羊抗兔多克隆IgG二抗（THERMO）稀释比例为1∶5 000，37℃孵育1h，TBST洗10min×3次。滴加ECL化学发光试剂，显影、摄片，测定蛋白浓度。

1.5 统计学处理采用SPSS 10.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用独立样本t检验。

2 结果

2.1 HE染色结果对照组肾脏各部位无明显病理变化，肾小球及肾小管间质无明显异常改变（图1a）。与对照组相比，模型组随着梗阻时间延长，肾小管扩张逐渐明显，肾实质区肾小球萎缩（图1b）。

图1 HE染色结果（a：对照组，正常肾实质；b：模型组，肾积水肾实质；HE染色，×200）

2.2 免疫组织化学染色结果CTGF蛋白染色阳性信号为棕黄色颗粒，阴性则无棕黄色着色。正常肾组织无或仅有微量表达，染色为颗粒状，着色稀疏（图2a）。而在模型组则表达增多，主要集中在肾小管上皮细胞胞质及肾间质中，并随梗阻时间延长染色强度加重且数量增多（图2b）。采用先天性肾积水患儿肾脏肾实质免疫组织化学染色作阳性对照，可见CTGF在肾小管上皮细胞胞质中表达明显（图2c）。

2.3 两组大鼠肾组织CTGF蛋白定量比较CTGF在模型组肾脏中呈阳性表达，且CTGF蛋白含量随着梗阻时间延长而增加，各时点表达水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.01），见表1和图3。

图2 免疫组织化学染色结果（a：对照组正常肾实质，CTGF无明显阳性表达；b：模型组肾积水肾实质，CTGF在肾小管上皮细胞胞质、肾间质组织中表达明显；c：先天性肾积水患儿肾脏肾实质，CTGF在肾小管上皮细胞胞质中表达明显；SABC法，×200）

表1 两组大鼠肾组织CTGF蛋白定量比较

图3 Western blot法检测两组大鼠肾组织中CTGF蛋白的表达（N：对照组，K：模型组）

3 讨论

1988年Almendral等[2]首先发现小鼠CTGF。1991年Bradham等[3]用亲和色谱法在人脐静脉内皮细胞的条件培养基中首次发现人CTGF，随后发现CTGF广泛存在于人的肾、肺、胰腺、动脉、肝、心和脑等多种组织器官中，成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、平滑肌细胞及某些癌细胞均可表达CTGF[4]。

近几年，国内外一些学者从分子水平研究了梗阻性肾病的改变，制作了输尿管完全及部分梗阻的动物模型。研究表明肾萎缩及肾间质纤维化与一些细胞因子表达改变有关，研究主要集中在表皮生长因子（EGF）[5]、TGF-β[6]等，CTGF为TGF-β1致纤维化作用的下游关键性效应因子，是一种新发现的细胞因子，其发现为进一步研究肾脏纤维化的研究提供了新方向。

前期通过临床实验对比研究UPJO引发肾积水患儿的患肾标本与正常肾组织标本，应用HE染色观察其形态学特征，免疫组织化学染色法、免疫电镜检测其CTGF的表达和分布差性，结果显示对照组肾脏各部位无明显病理改变；观察组肾实质见肾小球数目和面积减少、肾小管间质纤维化明显、呈灶状分布，肾盂及肾盂输尿管连接处的移行上皮细胞被挤压变形[7]；CTGF在患肾的肾实质、肾盂、肾盂输尿管连接处狭窄段中的表达明显增高[8]。

本实验采用输尿管结扎并剪断法制作肾积水模型，分别取术后1、2、4、8周4个时间点，观察其病理变化。结果显示CTGF在模型组中结扎侧肾脏各时间点均有阳性表达，主要分布于肾小管上皮细胞胞质及增生的肾间质细胞中，并且随着梗阻时间延长，CTGF阳性细胞数逐渐增多，表达增强。Western blot法显示，随梗阻病情进展，CTGF蛋白表达量增高，且差异有统计学意义，术后4周及8周的数值与前期研究CTGF在先天性肾积水患儿中表达结果相一致。由此，可在此模型上行肾积水CTGF的研究并行后续药物疗效观察等实验。

[1]AlmendralJ M,Sommer D,Macdonald-Bravo H,et al.Complexity of the early genetic response to growth factor in mouse fibroblass [J].MolCellBiol,1988,8(5):2140-2148.

[2]Bradham D M,Igarshi A,Potter R L,et al.Connective tissue growth factor:a cystine-rich mitogen secreted by human vascular endothelial cell is related to the SRC-induced immediate early gene product CEF-10[J].J CellBiol,1991,114(6):1285-1294.

[3]Chaqour B,Goppelt-Struebe M.Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins[J].PEBS J,2006,273(16): 3639-3649.

[4]Yang Y,Hou Y,Wang C L,et al.Renal expression of epidermal growth factor and transforming growth factor-betal in children with congenital hydronephrosis[J].Jiurology,2006,67(4):817-822.

[5]杨屹,吉士俊,赵国贵,等.转化生长因子在先天性肾积水中的表达研究[J].中华泌尿外科杂志,2001,10(22):604-606.

[6]曹广信,刘永东,李俊峰,等.先天性肾积水组织的超微结构及CTGF表达定位的电镜观察[J].中国医师杂志,2016,18(9):1393-1395.

[7]曹广信,李俊峰,张广平,等.结缔组织生长因子在UPJO引发肾积水儿童患者肾组织中的表达[J].贵州医科大学学报,2016,41(10):1224-1230.

[8]闵亚丽,蓝天座.单侧输尿管结扎致大鼠肾间质纤维化模型中CTGF、a-SMA的动态观察[J].贵阳医学院学报,2006,31(3):251-256.

Expression of CTGF in kidney tissue of rat hydronephrosis model

LIU Yongdong,HAN Jianqiang,ZHANG Guangping,et al. Department of Urology,Weifang People's Hospital,Weifang 261041,China

ObjectiveTo investigate the expression of connective tissue growth factor(CTGF)in kidney tissue of rat hydronephrosis model.MethodsForty eight healthy male Wistar rats were equally divided into two groups:in model group the left pelviureteric junction was dissociated and the ureter was ligated,and in control group the left pelviureteric junction was dissociated only.Six rats in each group were sacrificed 1,2,4 and 8 weeks after the operation and the left kidney was taken for histopathologicalexamination.TheexpressionofCTGFproteinandmRNAinkidneytissuewasdetectedwith immunohistochemistry and Western blot,respectively.ResultsThe expression of CTGF mRNA and protein in model group was significantly higher than that in the control group(P＜0.01)and increased with the time length of pelviureteric junction obstruction. ConclusionThe expression of CTGF is upregulated in the rat hydronephrosis model and positively correlated with the obstruction duration,indicating that CTGF might be used as a target of preventing congenital hydronephrosis.

RatsHydronephrosisCTGF

2016-06-26）

（本文编辑：陈丽）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.4.2016-966

261041山东省潍坊市人民医院小儿外科（刘永东、韩建强、李俊峰、张传光、胡强）；山东省兰陵县人民医院小儿外科（张广平）

胡强，E-mail：DHQ7936@163.com