权冰娥，李 树

(中国刑事警察学院 法医学系, 辽宁 沈阳 110035)

新一代DNA测序技术在法医实践中的应用及其研究进展

权冰娥，李 树

(中国刑事警察学院 法医学系, 辽宁 沈阳 110035)

近几十年来，随着分子生物学和基础医学的快速发展，新一代测序技术得到了开发和应用。DNA测序技术是人类探索生命奥秘的重要研究手段，随着 DNA测序技术应用于法庭科学中惩罚、打击罪犯的需要，其在法庭科学和法医实践中扮演着越来越重要的角色。测序技术历经一到四代的技术革新（二代之后的测序技术被称为新一代测序技术），测序具有低成本、时间短、高通量的特点，能够快速、准确地获取生物体的遗传信息，最重要的是开发出了更多的遗传位点。

新一代测序技术；法医学；高通量

一、引 言

在过去的几十年中，基因组测序技术几乎涉及到了生命科学的各个领域，极大地推动了生命科学和分子生物学的向前发展。由此人类从遗传层面对于自身的了解多了一个层次，但人们并不满足于当前的研究，对于发现探索生物体生命奥秘的渴望还在不断地增强。于是，人们将目光从单个基因位点的研究方向投向了全基因组层面，特别是人类基因组计划的提出。人类对生命科学的研究进入到了后基因组时代的今天，其中既包括了基础研究中的基因组学、转录组学和表观遗传学，也涉及了应用研究中的医学诊断和农作物育种等[1]。这些新兴研究方向的相继出现和发展，都需要对生物种类的全部基因组或全部的m RNA进行测序，因而要求测序技术更成熟、价格更低廉、周期更短的大规模测序方法出现。目前，法医 DNA实验室测序技术是利用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术和毛细管测序技术来检测短串联重复序列（short t andem repeats，STR）遗传标记的长度多态性信息及线粒体 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）序列多态性信息。这种测序技术在案件侦破和D NA数据库的建设方面具有广泛的应用。时至今日，新一代测序技术（next generation seque ncing，NGS）以高通量而著称，该技术还在发展研究中，广泛的用于法医学和法庭科学。本文对新一代测序技术的特点和研究进展做一介绍，并展望其在法医学中的应用前景。

二、第一代测序技术

Frederick Sanger和Walter Gilbert在1977年发明了 DNA末端终止法测序技术，从此开启了人类探索测序技术的大门，为后来生物科技的快速发展奠定了坚实的基础。Sanger法经过三十多年的逐步发展，能测出碱基对相对长度达 1000bp的序列，每个碱基的准确度也有了较大的提高。Sanger测序法是最经典的 DNA测序法，也是最基础的测序法。

第一代测序技术主要依赖于手工操作，而且试剂损耗量大、准确率低，以上种种因素极大地限制了测序的通量，降低了测序的效率，增加了测序的成本。

由于 Sanger测序法的种种限制和不足，在技术上经过不断变革，变革点主要分三类：1.用荧光染料标记物代替了对人体有害的放射性同位素标记物；2.用毛细管电泳技术代替了平板凝胶电泳技术；3.提高了平行测序的规模。

第一代测序技术耗时长、效率低、错误率高、低通量等特点极大地限制了其在法医实践中的应用，这些具有局限性的特点要求新一代测序技术的出现和发展。

三、新一代测序技术的研究进展

（一）第二代测序技术

第一代测序技术的不足致使第二代测序技术快速发展，第二代测序技术的发展进程是新型二代测序平台不断涌现、速度不断提升、成本不断降低、通量不断提高的过程。

1.454/Roche。2005年底，454公司推出了一系列利用微乳滴作为 PCR循环反应器的测序仪，进行准确、快速、大规模的测序。这一革命性的发明开创了边合成边测序的先河，摒弃了人工手动操作的繁琐，推开了自动化、高通量测序的大门。454公司研发的测序平台测序读长最长，目前一次测序可获得大于 100多万条读长达800～1000bp 的序列[2]（p.461），平均每个读长可达450bp。该技术与Sanger测序法相比，消耗的测序时间相对较少，仅需10h就能完成一个测序反应；测序速度也相对提高了100倍；准确性高达99%以上，快速方便，实现了大规模并行测序。

2.Solexa/Illumina。Genome Analyzer（GA）是 Illumina公司最初研发的测序仪，经过快速的升级，测序平台的通量从最初的 1G发展到大于 50G。Hiseq 2000是后来 Illumina公司新发明的测序仪，适用范围宽泛。它的核心技术是“DNA簇”和“可逆行末端终止”。一次运行能产生通量达600G的量。Hiseq 2000在读长上不如454公司推行的各种测序仪，每次读长大约介于 75-100bp。但就检测同聚物的准确性而言，其优势远远超过了454公司，它的出错率一般在1%～1.5%之间，其在 36bp的准确性是最高的。Illumina测序仪采用桥式 PCR扩增法，与以往各种测序仪的扩增法不同。Illumina测序技术有可扩展的超高通量，而且需要的样品量少，简单、快速、自动化、性价比高，因此是目前应用最广泛的二代测序技术。

3.ABI/SOLiDTM。SOLiD测序仪是 2007年通过ABI公司研制的，它的特点在于每个碱基能被阅读两次，由此可以检查错配率，大大地降低了出错的可能性，在单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)和测序的出错率上也有很好的区分度。以前的测序仪常用的是聚合酶，而SOLiD测序仪一改常态，用连接酶替换了传统的聚合酶，成为了一大新的创新点。该技术与 Sanger测序法相比，用荧光标记物代替了放射性同位素标记法，完全消除了放射性同位素对人体的有害性，同时也增强了辨识度。以上这些创新与改变，大大的提高了该技术的测序准确性，准确率达99.94%。SOLi D3.0的测序通量为20G，而测序长度仅为35-50bp，比Illumina测序系统的读长范围还小，因此在测序长度上有了一定的局限。

4.Danaher Motion/Polonator。Polonator测序仪是 Danaher Motion公司在之前测序仪的基础上新研发的测序仪器。Polonator测序仪市场价格低廉，能为广大用户接受，深受顾客们的喜爱，用户可以根据自己不同的研究目的变更测序操作条件。

5.Complete Genomics。Complete Genomic公司研发的 DNA纳米矩阵与组合探针锚定连接测序法具有很高的容错能力。一台仪器运行一天能测出一个或两个人的基因组，而且测序费用低，化学试剂的消耗量也进一步减少。

（二）第三代测序技术

PCR是第二代测序技术中重要也较核心的一步，由于在PCR扩增过程中容易出现碱基错配或缺失的问题，使得第二代测序技术的精确度仍不能最大化地提高。第三代测序技术正好弥补了这一缺陷，对DNA单个分子测序代替了PCR反应。

1.Helicos/HeliScope。HeliScope测序仪是市面上最先使用的单分子测序仪，它的独特之处是不需要对模板DNA进行扩增，只需在测序芯片上用荧光探测仪直接对单分子 DNA进行边合成边测序。虽然在检查碱基替换突变的准确性上很少出错，出错两次的概率为 0.001%且可以直接测序RNA，但在其他方面仍然存在一些不足。如：有大量的不发光、被污染且没被标记的碱基存在，在检测碱基的缺失时出错率极高；该测序仪的读长长度短；运行一次的产量低。

2.Pacific Biosciences/SMRT。SMRT(Sing le Molecule Real Time Sequencing)以芯片为载体进行测序。目前，单个片段的测序长度可达20kb，平均长度也有1kb多，测序消耗时间短，典型的测序运行一次时间低于 15分钟，一般的测序从样品制备到测序完成时间低于 24小时。测序速度达到 1.5nt/秒，该测序仪的准确性不高，准确率仅达85%，但它的出错是随机出现的，并不会随着读长的增加而增加，相信将来会慢慢被克服[3]。

3.Ion Torrent/基因解码器。Ion Torrent公司发明的基于硅芯片的个人染色体检测仪，是目前市面上体积规格最小、测序价格最低的基因解码器[4]。它能在2小时内解读1000万nt的长度。市场售价低廉，能被大多数人接受，科学家们在2012年用该仪器在24h内完成了人类基因组的测序。第三代测序技术可以直接测序RNA和甲基化的DNA序列，而第二代测序技术不能[5]。

（三）第四代测序技术

第二代和第三代测序技术都是依赖一定量的生物酶、化学试剂及荧光标记物的发光性能测序的。这就需要一系列与其相适应的生化反应系统、光学成像或监测系统的产品产生，大大地增加了仪器的复杂性和成本。而且读取序列耗时长、费用高、材料损耗大。为了避免以上这些弊端的出现，人们提出了第四代测序技术。

第四代测序技术的主要思想是研发出不需要荧光物质，不使用生化试剂，就可以直接、快速、低成本地测出DNA序列的新型测序技术。第四代测序技术存在一定的局限性，还处于概念性研究阶段，但就目前情况来看，将来的新一代DNA测序系统很可能从其中产生[6]。

四、新一代DNA测序技术在法医学中的应用

NGS技术在法医学中的应用，为刑事侦查和司法审判提供了极大的帮助。例如，Illumina公司研发的MiSeq FGx法医基因组学系统能够大规模并行测序 59个 STR，94个身份信息 SNP，54个祖先信息性SNP和24个表型信息性SNP。这些信息能为侦查提供方向，为司法审判提供有力证据，为个人识别及寻找祖先提供科学依据。目前测序技术在法医学中的应用主要有分析长度和序列多态性的STR技术、mtDNA全基因组分析、y-STR分析、预测种族背景和外观特征的SNP分析、微生物群落的分析及对表观遗传的分析。

（一）短串联重复序列分析

STR自动分型技术广泛应用于法医DNA分析实验室，具有自动化程度高、快速、灵敏、准确、稳定、重复性好等特点。现如今，法医DNA数据库的建立已完全依赖于STR分型技术，并且该技术是法医学领域的主流技术。NGS技术能显著提升STR遗传标记的多态性信息量，即由长度多态水平提高到序列多态水平，显著提升法庭科学核心 STR基因座的个体识别效力。Gettings KB[7]等人用NGS技术对不同人种的22个常染色体STR进行长度测序比较分析，发现有6个基因座的效果相当突出，6个基因位点分别是：D12S391、D2S1338、D21S11、D8S1179、VWA、D3S1358。Kyoung-Jin Shin[8]等人研究了17个STR基因座的序列多态性问题，运用NGS技术对STR序列多态信息进行分析，为法庭科学审判罪犯提供充足的依据。

（二）线粒体全基因组分析

mtDNA的测序最早采用的是Sanger测序法，为了能提高个人识别能力，必须要在mtDNA中使用更多的多态性位点。mtDNA在法医遗传学中的应用主要是对其高变Ⅰ区（16024～16365bp）和高变Ⅱ区（73～340bp）的DNA进行测序。mtDNA全基因组的研究受到的关注越来越多，范围越来越广，尤其在法医学中的个人识别、亲属鉴定以及嫌疑的排除方面的应用具有重要的作用。Parson[9]用大规模平行测序平台成功地从受损头发样本中测出mtDNA基因组数据。另外，对单倍型的遗传标记的判断依赖于准确的人群调查，已有的数据大多仅基于非编码区的数据，随着越来越多人认识mtDNA全基因组，对它的分析更全面，更准确[10]。

（三）Y染色体分析

测序并分析Y染色体上的基因位点，可以对男性进行个体识别，也可以解决来自同一父本的多个混合样本之间的鉴定问题。Willems[11]利用Illumina测序平台测定 Y染色体 STR全基因组中 2-6bp重复单元 Y-STR的突变率，他们使用1000个基因组计划和西蒙斯基因组多样性项目的数据，对4500个Y-STR进行基因分型，再通过追踪每个位点超过222,000个碱基来获得702个多态性 STR的突变率估计，这是迄今为止Y-STR突变率的最大收集量。最后，他们通过这一系列验证确定了在法医学和遗传谱系中具有潜在应用的Y-STR，评估了父亲和儿子之间Y染色体的区分能力并估算了Y-STR基因型的能力。

（四）种族背景和外观特征的预测分析

近年来，全基因组关联分析(genome wide association study，GWAS)研究已经确定了一些SNP可以帮助预测种族背景和外观特征。这在帮助锁定或刻画罪犯的问题上具有极大的帮助，目前有报道称在预测头发或皮肤颜色的相似度已经达到了 80%～90%，但在身高的预测上差异较大，准确性不高。也可以利用NGS技术给外观特征进行画像，例如除了可以较准确地预测头发、眼睛、皮肤的颜色外，还能推测鼻子、耳朵、双眼皮、单眼皮、嘴唇和软组织的特征及头发的曲直等，帮助进行个体识别[12]。这为提高办案能力，缩小侦查范围，为及时抓捕并制裁罪犯提供有力的帮助。

Churchill[13]利用 MiSeq FGx系统对 725个样本中的四类主要人群（中国人，非裔美国人，美国高加索人和西南西班牙裔）的剖面完整性、读数深度、相对基因座表型和等位基因的覆盖率进行了详细的性能评估。通过对172个SNP基因座的等位基因频率和人口数据进行统计，发现每个样品生成的祖先信息和表型信息，和预测的人群分类几乎一致。

（五）法医微生物分析

微生物信息的分析在法医学领域中的研究越来越广，越来越重要。Habtom[14]用Roche 454，Illumina MiSeq和IonTorrent PGM平台的高通量测序技术区分了相邻土壤中的微生物种群，说明了其潜在的微生物痕迹在法医学鉴定中的作用。Guo[15]使用Illumina MiSeq测序仪研究了细菌群落可以用作估计死者的死亡时间，但还需要进一步的研究。

（六）表观遗传分析

表观遗传学是指在DNA序列不变的情况下，由其他机制引起的可遗传的改变，主要包括组蛋白修饰、DNA甲基化、染色质重塑等[16]。表观遗传学的研究与NGS技术密不可分，现在已形成了以 NGS为基础的各种表观遗传学测序及研究方法，如：全基因组亚硫酸氢盐测序法、甲基化DNA免疫共沉淀测序、染色质免疫共沉淀测序技术等等[17]。在法医学的应用上，表观遗传在双胞胎的研究中有了极大的进展。有研究表明，同卵双胞胎的表观遗传特征随着年龄的增长，变化越来越大。

综上所述，科技在向前发展，新一代测序技术也在不断更新和完善，其在法医学领域将发挥更大的作用。

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[16]丁 勇,许 超,吴季辉,施蕴渝,臧建业,蔡 刚.表观遗传学研究进展[J].中国科学：生命科学,2017(1)：3-15.

[17]沈 圣,屈彦纯,张军.下一代测序技术在表观遗传学研究中的重要应用及进展[J].遗传,2014(3)：256-275.

（责任编辑：李 刚）

Application of New Generation DNA Sequencing Technology in Forensic Practice and Its Research Progress

QUAN Bing-e，LI Shu
(Department of Forensic Medicine, National University of China, Shenyang Liaoning 110035, China)

In recent decades, with the rapid development of molecular biology and basic medicine, a new generation of sequencing technology has been developed and applied. DNA sequencing technology is an important research method o f hum an exploration o f life myst ery. With t he app lication o f DNA sequencing technology in court science to punish and combat crime, it plays an increasingly important role in forensic scie nce and forensic p ractice. Sequencing te chnology is a ge neration, two generation,three gen erations and four g enerations o f techno logical innov ation (second gen eration aft er the sequencing technology is called a new g eneration of sequencing technology), sequencing with lo w cost,time is short, high-throughput characteristics, can quickly and accurately Access to genetic information of organisms, the most important thing is to develop more genetic sites.

new generation sequencing technology; forensic science; high throughput

D919.2 文献标识码：A 文章编号：2096-0727(2017)06 -0045-05

2017-08-30

权冰娥（1993-），女，甘肃白银人，硕士研究生。研究方向：人体检验与鉴定技术。

李 树（1964-），女，吉林辽源人，教授，双学士。研究方向：法医物证学。