李晓波，徐 芳

(山东省滕州市枣庄科技职业学院医学系 277500)

论著·基础研究

姜黄素通过影响NF-κB信号通路促进肺癌细胞的放射敏感性

李晓波，徐 芳

(山东省滕州市枣庄科技职业学院医学系 277500)

目的 探讨姜黄素联合放射治疗对肺癌NCI-H460细胞的活性及肺癌小鼠放射敏感性的影响。方法 把肺癌NCI-H460细胞分为4组：空白对照组、姜黄素组、γ射线组及γ射线照射与姜黄素的联合组；然后对各组分别应用噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖，Annexin-V/PI染色法检测细胞周期分布及凋亡，Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax的表达，RT-PCR 检测核因子κB(NF-κB)基因表达情况。另外，建立小鼠肺癌模型同样分为对应的4组,姜黄素按照1 mg/kg经尾静脉注射于小鼠,肿瘤局部进行剂量为5 Gy射线照射,处理28 d后，比较不同处理组小鼠瘤体体积。结果 与空白对照组、姜黄素组和γ射线组比较，联合组NCI-H460增殖率明显降低(P<0.05)，凋亡率明显增加(P<0.05)，抑凋亡蛋白Bcl-2表达明显降低(P<0.05)，促凋亡蛋白Bax表达明显增高(P<0.05)，NF-κB mRNA表达明显降低(P<0.05)，并且肿瘤的体积有明显减少(P<0.05)。结论 姜黄素可通过抑制γ射线处理条件下NF-κB的表达并促进细胞的G2/M期阻滞来增强肺癌NCI-H460细胞对γ射线的敏感性。

姜黄素；γ射线；细胞增殖；NF-κB;辐射耐受性

目前我国约有70%以上的肿瘤患者需要放疗，并且对于许多肺瘤患者而言，放疗是可用的治疗方法之一[1]。但肺瘤患者往往在放疗过程中出现抵抗，从而导致治疗效果不理想[2-3]。因此，如何提高肺癌的放疗敏感性，改善患者生活质量是目前急需解决的问题。

姜黄素(curcumin)是我国传统中药姜黄的主要活性成分。其主要成分包括多种调控生长因子，趋化因子及转录因子等，因此具有抗炎、抗氧化、抗凝、降血脂等多方面生物功能[4]。研究显示，姜黄素可抑制体内、外肿瘤细胞的生长，是一种具有良好应用前景的抗癌新药[5]。体外研究发现，姜黄素通过抑制(NF-κB)信号通路增强肿瘤细胞的放射敏感性[6-8]。但姜黄素能否增强肺癌的放疗敏感性，目前还不清楚。本研究选用肺癌NCI-H460细胞系为研究对象，研究姜黄素对肺癌NCI-H460细胞放疗敏感性的影响，为探索肺癌治疗的新途径提供实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物来源 小鼠Lewis肺癌瘤系,购自北京协和细胞资源中心。C57BL/6纯系小鼠，雄性，鼠龄4～6周，体质量16～22 kg，购自北京大学第一医院实验动物中心。

1.1.2 实验试剂和仪器 姜黄素(上海同田生物技术公司)， RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(美国Gibco公司)，二甲基亚砜(DMSO，天津市天力化学试剂有限公司)，青霉素钠和链霉素(华北制药有限责任公司)，噻唑蓝(MTT，美国Sigma公司)，二乙基亚硝胺(天津化学试剂研究所)，Trizol(美国Invitrogen公司)，流式细胞仪(美国BD公司)，抗体Bcl-2、Bax(Cell Signal公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒(美国BD公司)，Spectra MR型酶标仪(美国Dynex公司)。

1.2 方法

1.2.1 NCI-H460细胞的γ射线照射条件 在室温下采用60 Co γ 射线全身一次性照射，吸收剂量率1.701 Gy/min，一次性给予NCI-H460细胞5 Gy的吸收剂量。

1.2.2 NCI-H460的培养及传代 采用含10%新生牛血清的RPMI-1640完全培养液，调整细胞密度为5×105个/mL接种于培养瓶中，待细胞长至80%～90%密度时，按比例传代。实验时取生长状况良好的对数生长期细胞，分为空白对照组、γ射线组(5 Gy)、姜黄素组(10 μmol/L)和γ射线联合姜黄素的联合组(5 Gy射线联合10 μmol/L姜黄素)。

1.2.3 细胞增殖实验 采用MTT法检测细胞增殖。取对数生长期NCI-H460细胞，调整细胞浓度为1.0×104个/mL，接种于48孔培养板中，按照试验分组采用10 μmol/L姜黄素及5 Gy γ射线分别处理48 h，弃去培养基，每孔加入50 μL MTT，37 ℃继续培养4 h，加200 μL DMSO，使甲瓒结晶完全溶解，酶标仪以参考波长630 nm，测量波长490 nm处的各孔的吸光度值(A)。实验重复3次取平均值，计算细胞增殖活性。计算公式为细胞增殖抑制率(%)=(对照组A值-实验组A值)/对照组A值×100%。

1.2.4 细胞凋亡实验 应用PI和Annexin V染色的方法检测细胞凋亡。取对数生长期NCI-H460细胞，接种于6孔培养板中。根据分组加入10 μmol/L姜黄素及5 Gy γ射线分别处理48 h。收集细胞及其上清液，1 000 r/min离心5 min后弃上清液，用预冷PBS将沉淀细胞清洗3遍，然后加入500 μL的 Binding Buffer悬浮细胞；加入5 μL Annexin V-FITC混匀后，加入5 μL Propidium Iodide混匀，室温避光反应15 min；1 h内流式细胞仪检测。FITC阳性代表细胞凋亡发生，PI阳性代表细胞死亡。

1.2.5 细胞凋亡蛋白分析实验 应用蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测凋亡相关蛋白的表达。取上述收集的细胞接种于6孔板中，根据实验设计分组加入姜黄素及γ射线处理48 h后收集细胞。提取蛋白质，进行15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白。半干转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,脱脂奶粉封闭1 h；分别加入一抗Bcl-2(1∶500)和Bax(1∶500)，4 ℃摇床孵育过夜；洗膜液清洗3次(每次10 min)，加入二抗(1∶5 000)室温孵育3 h；洗膜液清洗3次(每次10 min)，用ECL发光显色后在X射线洗片机(HQ 320XT)上曝光检测，采用Quantity-One 4.6.2软件进行图像分析，以β-actin作为内参。

1.2.6 细胞周期分析实验 按照上述分组，取对数生长期NCI-H460细胞，接种于6孔板中，根据实验设计分组加入姜黄素及γ射线分别处理48 h后，收集细胞。用70%冰乙醇悬浮，吹打均匀，4 ℃放置12 h，PBS洗涤去乙醇，加入0.5 mL PBS重悬细胞，加入RNaseA至终浓度100 μg/mL，37 ℃ 温浴30 min。加入PI至终浓度50 μg/mL室温孵育30 min，采用流式细胞仪检测细胞周期。

1.2.7 mRNA表达水平的分析 采用RT-PCR检测NF-κB mRNA表达水平,按照上述分组，取对数生长期NCI-H460细胞，接种于6孔板中，根据实验设计分组加入姜黄素及γ射线处理48 h，收集细胞。采用Trizol法提取细胞总mRNA，使用反转录试剂盒合成cDNA模板。采用RT-PCR分析NF-κB mRNA表达水平的变化。RT-PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s；72 ℃ 8 min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，0.5%溴化乙锭(EB)染色后，凝胶成像仪观察图像，分析各组间mRNA表达水平的差异。

1.2.8 C57BL/6小鼠Lewis肺癌模型建立及体内给药、获取标本 将小鼠Lewis肺癌瘤系制备成单细胞悬液，在小鼠右后肢皮下接种瘤细胞悬液，1×107个/只。将40只荷瘤小鼠随机分为4个组，分为空白对照组、γ射线组(5 Gy)、姜黄素组(1 mg/kg)和γ射线联合姜黄素的联合组(5 Gyγ射线联合1 mg/kg姜黄素)。姜黄素按照1 mg/kg经尾静脉注射于小鼠,肿瘤局部进行照射，照射剂量为15 Gy,治疗后28 d，分别将小鼠处死获取肿瘤组织，标本冻存于-20 ℃冰箱。用游标卡尺测量各组小鼠肿瘤长径(a)及短径(b)，计算肿瘤平均体积。肿瘤体积计算公式：肿瘤体积(mm3)=a×b2/2。

2 结 果

2.1 MTT法测定姜黄素与γ射线对NCI-H460细胞增殖的影响 从图1可以看出，空白对照组NCI-H460细胞增殖活跃，而经过10 μmol/L姜黄素、5 Gy的γ射线或γ射线联合姜黄素处理48 h后姜黄素组，γ射线组，联合组，细胞的增殖均受到不同程度的抑制，其中联合组对细胞增殖活性抑制最明显，差异有统计学意义(P<0.05)。

a:P<0.05，与其余各组比较。

图1 姜黄素和γ射线对NCI-H460细胞增殖活性的影响

2.2 流式细胞术检测γ射线与姜黄素对NCI-H460细胞凋亡率的影响 与空白对照组[(2.29±0.08)%]相比，γ射线组[(2.29±0.73)%]或姜黄素组[(2.41±0.59)%]细胞凋亡率有轻微增加，差异无统计学意义(P>0.05)；而联合组[(215.21±0.32)%]明显促进细胞凋亡，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 γ射线与姜黄素对NCI-H460细胞周期的影响 流式细胞仪检测细胞周期的结果表明，γ射线组或姜黄素组G2/M期细胞增多，但与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。而联合组与对照相比较则可明显提高G2/M期细胞比例，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 姜黄素和γ射线对NCI-H460 细胞周期的影响

a:P<0.05,与其余各组比较。

2.4 γ射线与姜黄素对NCI-H460细胞凋亡相关蛋白表达的影响 与对照组比较，联合组NCI-H460细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2的表达明显降低，促凋亡蛋白Bax的表达明显升高(P<0.05)，而γ射线和姜黄素单独处理则对Bcl-2和Bax蛋白的表达无显著影响，见图2。

A：Bcl-2蛋白表达；B：Bax蛋白表达；1：空白对照组；2：联合组；3：姜黄素组；4：γ 射线组。

图2 姜黄素和γ射线对NCI-H460细胞凋亡蛋白表达的影响

2.5 γ射线与姜黄素对NCI-H460细胞NF-κB mRNA表达的影响 与空白对照组比较，联合组NCI-H460细胞NF-κB mRNA的表达明显增加(P<0.05)，而γ射线或姜黄素单独处理对NF-κB的表达无显著影响，见图3。

a：P<0.05，与其余各组比较。

图3 姜黄素和γ射线对NCI-H460细胞NF-κB mRNA表达的影响

2.6 γ射线与姜黄素对肺癌小鼠肿瘤体积的影响 C57BL/6小鼠经过接种肺癌肿瘤细胞两周后肿瘤直径增至5～8 mm时，根据分组，对小鼠进行相对应的治疗，与空白对照组相比，联合组明显抑制肿瘤的生长(P<0.05)，见图4。

a：P<0.05，与其余各组比较。

图4 姜黄素和γ射线对肺癌小鼠肿瘤体积的影响

3 讨 论

肺癌逐渐成为危害人类生命的一种主要疾病之一。近年来许多学者尝试采用常规的化疗药等来增加放射治疗的效果[9-10]。尽管在某些情况下这种方法可以引起更好的治疗效果，但受到特定了一些因素的限制，包括增加的毒性反应，正常组织的损伤，增加的不良反应等，因此获得最小毒性的放疗增敏剂对肺癌患者至关重要。

目前中药放射敏感性的研究较少，探索中药在此方面的作用具有重要意义，姜黄素便是其中之一。研究发现，姜黄素在达到12 mg/d的剂量时，无明显的不良反应出现。也有研究发现，姜黄素对结肠癌具有预防作用[11]。本实验研究姜黄素对肺癌NCI-H460细胞放疗增敏的影响。结果发现，经过10 μmol/L姜黄素处理肺癌细胞，再进行5 Gy γ射线处理，能够明显抑制细胞增殖，增加细胞凋亡及促进促凋亡相关蛋白Bax的表达，抑制抑凋亡相关蛋白Bcl-2的表达。说明姜黄素可增强肺癌NCI-H460细胞对γ射线的敏感性。此外，肺癌动物模型结果显示，γ射线与姜黄素联合处理可明显抑制肿瘤生长，说明联合治疗能起到很好的抑瘤效果。

大量的研究表明，NF-κB与肿瘤的放射耐受性密切相关。例如，在恶性胶质瘤、乳腺癌、膀胱癌、食道上皮细胞癌中均发现放射激活了 NF-κB，而激活的NF-κB可保护细胞免受放射影响而死亡，从而在细胞放射耐受性上起作用[12-13]。相反，通过对NF-κB的抑制可增加放射敏感性，主要表现为DNA 结合能力减弱、 凋亡增加，或细胞生长和克隆源生存下降[6,14-16]。本次研究发现，经过姜黄素和γ射线处理肺癌细胞后，显著抑制NF-κB mRNA表达水平，提示姜黄素可能是通过抑制NF-κB的表达增强肺癌细胞放疗敏感性。另外，NF-κB可控制细胞周期调控基因如 C-MYC、Cyclin D1的表达，从而使G1期及 S 期细胞增加，而G1/S 期、G2/M 期细胞减少[17]。而诱导肿瘤细胞G2/M期阻滞是影响肿瘤细胞放射敏感性的重要原因[18]。本次研究也发现，经过姜黄素和γ射线处理后的肺癌细胞，可导致细胞的G2/M期阻滞，从而进一步说明姜黄素是通过抑制NF-κB的表达，并进而诱导肿瘤细胞G2/M期阻滞达到增强肺癌细胞放疗敏感性。

综上，本研究发现姜黄素能够增强肺癌细胞系NCI-H460的放疗敏感性，而这种作用可能与其对NF-κB活性的抑制相关。本研究为姜黄素应用肺癌的增敏治疗提供了新的实验依据，为其在临床中的应用奠定了基础。

[1]Haslett K,Pöttgen C,Stuschke M,et al.Hyperfractionated and accelerated radiotherapy in non-small cell lung cancer[J].J Thorac Dis,2014,6(4):328-335.

[2]Brindley DN,Lin FT,Tigyi GJ.Role of the autotaxin-lysophosphatidate axis in cancer resistance to chemotherapy and radiotherapy[J].Biochim Biophys Acta,2013,1831(1):74-85.

[3]Glide-Hurst CK,Chetty IJ.Improving radiotherapy planning,delivery accuracy,and normal tissue sparing using cutting edge technologies[J].J Thorac Dis,2014,6(4):303-318.

[4]Gupta SC，Patchva S，Koh W.et al.Discovery of curcumin,a component of golden spice,and its miraculous biological activities[J].Clin Exp Phamacol Physiol，2012，39(3)：283.

[5]Sharma RA,Gescher AJ,Steward WP.Curcumin:the story so far[J].Eur J Cancer，2005，41:1955-1968.

[6]Aggarwal BB,Kumar A,Bharti AC.Anticancer potential of curcumin:preclinical and clinical studies[J].Anticancer Res，2003，23:3633-3698.

[7]Mörth C,Valachis A.Single-agent versus combination chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced non-small cell lung cancer and performance status 2:a literature-based meta-analysis of randomized studies[J].Lung Cancer,2014,84(3):209-214.

[8]Asai N,Ohkuni Y,Kaneko N.Relapsed small cell lung cancer:treatment options and latest developments[J].Ther Adv Med Oncol，2014,6(2):69-82.

[9]Cruz-Correa M,Shoskes DA,Sanchez P,et al.Combination treatment with curcumin and quercetin of adenomas in familial adenomatous polyposis[J]．Clin Gastroenterul Hepatol,2006,4(8):1035-1038．

[10]Berger R，Jennewein C，Marschall V，et al.NF-κB is required for Smac mimetic-mediated sensitization of glioblastoma cells for γ-irradiation-induced apoptosis[J].Mol Cancer Ther,2011,10(10):1867-1875.

[11]MinevaND，WangX，YangS，etal.InhibitionofRelBby1，25-dihydroxyvitaminD3promotessensitivityof breast cancer cells to radiation[J].J Cell Physiol,2009,220(3)：593-599.

[12]Koga F，Yoshida S，Tatokoro M，et al.Erb B2 and NFκB overex-pression as predictors of chemoradiation resistance and putative targets to overcome resistance in muscle-invasive bladder cancer[J].PLoS One,2011,6(11)：e27616.

[13]Chen MF，Lu MS，Chen PT，et al.Role of interleukin 1 beta in esophageal squamous cell carcinoma[J].J Mol Med (Berl),2012,90(1)：89-100.

[14]Munshi A，Kurland JF，Nishikawa T，et al.Inhibition of constitutively activated nuclear factor-kappa B radiosensitizes human melanoma cells[J].Mol Cancer Ther,2004,3(8)：985-992.

[15]Locke JE，Bradbury CM，Wei SJ，et al.In domethacin lowers the threshold thermal exposure for hyperthermic radiosensitization and heat-shock inhibition of ionizing radiation-induced activa-tion of NF-kappa B[J].Int J Radiat Biol,2002,78(6)：493-502.

[16]Russo SM，Tepper JE，Baldwin AS Jr，et al.Enhancement of radiosensitivity by proteasome inhibition： implications for a role of NF-kappa B[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2001,50(1)：183-193.

[17]Li X，Liu D，Liu X，et al.Cp G ODN107 potentiates radiosensitivity of human glioma cells via TLR9-mediated NF-κB activation and NO production[J].Tumour Biol,2012,33(5)：1607-1618.

[18]Qiao Q，JiangY，Li G．Curcumin improves the antitumor effect of X-ray irradiation by blocking the NF-κB pathway：an in-vitro study of lymphoma[J]．Antieancer Drugs，2012，23(6)：597-605．

Curcumin induce the radiosensitivity of human lung carcinoma NCI-H460 cells through the NF-κB pathway

LiXiaobo,XuFang

(DepartmentofMeolicme,VocationalCollegeofScienceandTechnology,Tengzhou,Shandong277500,China)

Objective To study the combination effect of curcumin and γ ray on the activity of human lung carcinoma NCI-H460 cells and explore the sensitization of curcumin to γ ray.Methods The NCI-H460 cells proliferation were detected by MTT,the cell cycle and apoptosis by flow cytometry.The expression of Bcl-2 and Bax were detected by Western Blot and the NF-κB gene expression by RT-PCR.In addition,the mice model of lung cancer was randomly divided into 4 groups:control group,curcumin group,γ ray group and combination group.After 28 days,the tumor volume was measured.Results The proliferation and cell cycle of NCI-H460 cells were inhibited and the apoptosis was increased in combination group.In addition,compared with curcumin group or γ ray group,the expression of Bcl-2 was inhibited,but the expression of Bax was increased and the mRNA expression of NF-ΚB was inhibited in combination group(allP<0.05).Also in combination group the tumor volume was significantly inhibited compared with curcumin group or γ ray group(allP<0.05).Conclusion Curcumin might induce the radiosensitivity of Human Lung Carcinoma NCI-H460 cells through the pathway.

curcumin;γ ray;cell proliferation;NF-κB;radiation tolerance

李晓波(1980-),讲师，硕士，主要从事基础医学研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.06.009

R734.2

A

1671-8348(2017)06-0749-03

2016-10-19

2016-11-17)