钟春素 ，杨 华  

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学植物科学实验教学示范中心，湖南 长沙 410128）

手性药物分析方法研究进展

钟春素1，杨 华2

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学植物科学实验教学示范中心，湖南 长沙 410128）

从手性药物的概念入手，阐述了高效液相色谱法、毛细管电泳法、分子印迹技术、高速逆流色谱法、超临界流体色谱法和生物酶法等几种常用的手性药物分析技术的原理、特点及研究实例，以期为手性药物分离技术提供指导。

手性药物；分离；色谱法；研究进展

目前，40%～50%的药物具有手性。而手性药物的2种不同对映体的生物活性存在较大差异，一个可能是有效成分，而另一个可能是低效甚至是有毒成分。在人体内，两对映体也可发生相互转化，这就导致了很多药物服用之后出现副作用。因此，在对药物进行理化性质分析的时候，手性药物的分离技术发挥了重要作用。笔者从手性药物的概念入手，阐述了近几年常用的几种手性药物分析技术的原理、特点及研究实例，以期为手性药物分离技术提供指导。

1 手性药物概述

手性药物即在药物分子结构中引入手性中心所得到的一对互为镜像与实物的对映异构体。目前，临床上使用的药物约有40%～50%是手性药物。手性药物的药理可能有以下4种情况：（1）其中一个对映体具有预期的药理活性，而另一个对映体却不存在；（2）两个对映体有类似或者接近的药理活性；（3）两对映体药理活性不相同，而且其中一个有可能是其消旋体药物副反应的根源；（4）两对映体药理活性相同但两者作用强度不同[1]。在药代动力学方面，手性药物也可能在体内的吸收、分布、代谢和排泄中表现出一定程度的立体选择性。因此进行手性药物的分离以及质量控制、药效评价具有很重要的意义。

2 手性药物分析技术

2.1 高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱法自20世纪70年代兴起以来便成为药物分析最常用的方法之一。在拆分手性药物对映体的应用中，HPLC法分为直接法和间接法，直接法是将不对称中心引入分子间，包括手性固定相法和手性流动相添加剂法；间接法又称手性试剂衍生化法，它与前者所不同的地方在于它是将不对称中心引入到分子内部。

陈立云等[2]通过对照品法测定安立生坦的对映异构体，用Chiral-pakAD-H（4.6 mm×250 mm，5 μm）作色谱柱，正己烷-乙醇（95︰5）为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为263 nm。结果表明，高效液相色谱法能使安立生坦与其对映异构体有效分离，且分离度达8.0以上，质量浓度在1.04～5.18 μg/mL之间有良好线性关系。

王丽娜等[3]使用正相高效液相色谱法，以DAICELOJ-H作手性柱，正己烷-乙醇-二乙胺为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长230 nm，柱温维持30℃，进样量20 μL，测定左舒必利原料中的杂质及其含量。结果表明，左舒必利的分离度在此实验条件下为2.1，在1.648～16.48 μg/mL之间线性关系良好，检测限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分别为0.099和0.198 μg/mL，通过该方法检测得到3批原料中手性杂质含量为0.47%～0.50%。

郑振等[4]采用反相高效液相色谱法，以环糊精作固定相分离抗抑郁药米那普仑对映体。结果表明，经过多次拆分条件的优化，确定出采用乙酰基-β-环糊精手性柱AstecCYCLOOBONDTMI2000AC作固定相，0.1%的乙腈（体积分数）和pH值5.0的醋酸三乙胺溶液为流动相，流速为0.4 mL/min，柱温维持在25℃，检测波长220 nm，米那普仑对映体能够快速分离，且分离度达1.74。

2.2 毛细管电泳法（CE）

CE是20世纪80年代初期由传统电泳技术与色谱技术结合发展起来的一门新技术。该技术操作简便，分离模式多样化，分离效率高。近年来被广泛应用于医药科学、食品检测、生命科学等领域。

付小帅等[5]采用手性选择剂羧甲基-β-环糊精（CM-β-CD），以NaH2PO4缓冲溶液为电解质，采用未涂层熔融石英材料毛细管柱，在20 kV电压下分离佐匹克隆、卡维地洛、普萘洛尔、氧氟沙星和尼卡地平5种碱性药物对映体。结果表明，佐匹克隆等5种药物在该试验条件下对映体的分离度分别为5.7、6.2、5.0、9.8和3.0，说明CM-β-CD对佐匹克隆等5种手性药物有较高的对映体选择性。

董树清等[6]采用超支化聚合物涂覆于表面的熔融石英作毛细管柱，以硼砂-氢氧化钠为背景运行缓冲液，分离阿苯达唑亚砜等几种手性药物的基线。结果表明，超支化聚合物应用在毛细管电泳技术中能很好地实现手性药物的分离，并且分离效率高。

孙嘉怡等[7]采用羧甲基-β-环糊精（CM-β-CD）作手性选择剂，使用未涂层的石英毛细管柱，电解质为NaH2PO4缓冲溶液，在20 kV电压下拆分羟氯喹、沙丁胺醇、氯苯那敏和班布特罗4种手性药物。结果表明，羟氯喹、沙丁胺醇、氯苯那敏和班布特罗的分离度分别为6.79、1.56、10.49和3.75，说明CM-β-CD针对这4种手性药物有很高的选择性。

左莉华等[8]采用手性选择剂硫酸化-β-环糊精（S-β-CD），以未涂壁石英材料作毛细管柱，背景电解质采用NaH2PO4缓冲溶液，在电压为20 kV下拆分曲马多、利阿唑、苯丙哌林、1-苄基-3哌啶醇和联苯苄唑5种手性药物。结果表明，5种药物的分离度分别为6.10、2.80、10.41、5.50和4.09，说明S-β-CD对这5种手性药物的选择性较高。

2.3 分子印迹技术（MIT）

分子印迹技术是一种通过设计合成对目标分子（如药物等）具有亲和力和特异选择性的分子印迹聚合物的技术，该技术的发明启发于抗原-抗体的专一性识别。因分子印迹聚合物（MIPs）具有构效预定性、特异性、稳定性、适用广泛性和结合能力高等特点，在诸多领域得到广泛应用[9]。

邴乃慈等[10]以4-乙烯基吡啶为功能单体，通过支撑膜聚偏氟乙烯中空纤维超滤膜和模板分子S-（+）-萘普生设计合成分子印迹复合膜，采用紫外光谱法研究了目标分子与模板分子之间的相互作用。结果表明，分子印迹聚合物膜中存在着与模板分子互补的三维空间结构以及由功能基的孔穴组成的通道，该通道能够选择性地透过S-（+）-萘普生，在亲和力和压力的共同作用下，最大分离因子达到6.19。

赵潇等[11]采用S-布洛芬作印迹分子，接枝环糊精的醋酸纤维素复合物作铸膜材料，通过相转化法合成了具有手性拆分功能的分子印迹膜，并通过渗透试验考察了所制备分子印迹膜对外消旋布洛芬的手性拆分效能。结果表明，在β-环糊精接枝率为29.01%（质量分数），模板分子浓度比为1︰10，铸膜液质量分数为12.5%的条件下，分子印迹膜对右旋布洛芬的分离因子可达2.09。

2.4 高速逆流色谱法（HSCCC）

高速逆流色谱是利用高速旋转的螺旋管内两相溶剂体系建立起的一种特殊单向性流体力学平衡，两相其中一相是固定相，另一相是流动相，经过连续洗脱过程能保留大部分固定相的分离方法，因其具有无污染、样品无损失、高效、大制备量分离等特点而被广泛应用。

Tong等[12]使用羟丙基-β-环糊精手性拆分甲氧萘丙酸，研究了对手性选择性和分配系数均有影响的操作条件，即8种水相pH值及9种溶剂系统，最终挑选出最优的操作条件，最终药品回收率达89%，并且拆分得到的单体纯度高达99.5%以上。

沈芒芒[13]在分析型高速逆流色谱上采用N-n-十二烷基-L-脯氨酸作手性配体，铜离子作配位金属，在正丁醇-正己烷-水三相溶剂体系或正丁醇-水两相溶剂中实现了7种α-羟基酸类手性化合物的手性拆分，成功分离了76 mg 2-氯扁桃酸、74 mg 4-甲氧基扁桃酸和74 mg扁桃酸，并通过液相检测，得出对映体的纯度均超过96%，回收率在82%～90%之间。

谢娜[14]将水溶性手性萃取剂β-环糊精（β-CD）及其衍生物添加在水相中，将脂溶性手性选择剂酒石酸酯类衍生物添加至有机相中，采用疏水性相转移剂四苯硼钠，通过HSCCC成功分离了苯基乳酸、酮康唑等外消旋物质。

2.5 超临界流体色谱法（SFC）

超临界流体色谱法是指采用超临界流体作流动相的色谱法。20世纪60年代Klesper等[15]首次采用超临界流体作色谱流动相分离了卟啉衍生物，超临界流体色谱法也在此之后慢慢被发展起来。SFC兼具HPLC和GC两种技术的优点，是一种分析难挥发及不耐热的大分子化合物和生物试样的有效方法。

戴涛等[16]考察了ChiralpakAD-H、ChiralpakAS-H、ChiralcelOD-H等5种手性柱的分离效果，并分析了分离度的影响因素，包括改性剂的种类、温度、浓度及背压。结果表明，采用ChiralpakAD-H柱、以异丙醇（占流动相比例为18%）为改性剂、背压为14 MPa、温度为29.85℃时，齐留通对映体达到最佳分离，分离度为11.5，两对映体出峰时间分别为4.59、7.35 min。

金薇等[17]采用色谱柱ChiralcelOD，以超临界二氧化碳-无水乙醇作流动相，流速为2.0 mL/min，背压为15 MPa，在220 nm波长处分离测定左乙拉西坦及其右旋异构体。结果表明，左乙拉西坦与其右旋异构体依次出峰，分离度达3.7，两者的浓度线性范围在0.002～0.041 mg/mL之间，相关系数分别为0.999 5和0.999 4（n=7），检测线均为10 ng（S/N=3）。

Chennuru等[18]采用新一代手性柱ChiralpakIA，ChiralpakIB及ChiralpakIC，在SFC和LC两种分离模式下，对比6种质子泵抑制剂（兰素拉唑、泮托拉唑、奥美拉唑、艾普拉唑、雷贝拉唑、泰妥拉唑）的对映选择性。结果表明，在SFC和LC模式下，各对映异构体洗脱顺序是相同的，3种新型手性柱的分离性能由低到高依次是ChiralpakIB＞ChiralpakIA＞ChiralpakIC。

2.6 生物酶法

生物酶法作用条件温和，副反应少，产物分离纯化简便，污染及能耗均较低，且产物光学纯度高，在手性药物中间体的研发中应用非常广泛[19]。

傅德进等[20]通过单因素优化及正交试验确定了摩氏摩根菌的最佳产酯酶培养基配方，以摩氏摩根菌菌体作催化剂，选择性地拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯，目标物转化率达45%，对映体的过量值超过94%，为酶法在普瑞巴林手性中间体生产中的应用打下了基础。

于芳等[21]使用生物酰化酶Ⅰ有选择性的将被乙酰化的外消旋3-溴苯丙氨酸进行去酰胺化，分离得到了互为异构体的溴代苯丙氨酸盐酸盐，并通过高分辨质谱、旋光值及核磁共振等数据进一步证实了该试验结果的可靠性。结果表明，酰化酶Ⅰ可以有效应用于含溴取代的苯丙氨酸衍生物的手性拆分。这为含有苯丙氨酸衍生物结构的天然产物分子和药物分子的合成提供一个简易可行的路线。

张之建等[22]以固定化脂肪酶为催化剂，以异丙醚为溶剂体系，底物采用乙酸乙烯，来拆分扁桃酸，当乙酸乙烯酯与扁桃酸摩尔浓度比为6，扁桃酸浓度为180 mmol/L，温度为50℃时，乙酸乙烯的转化率为50%，产物对应体过剩量和底物对应体过剩量超过99.9%。这表明脂肪酶对扁桃酸选择性很高。

3 展 望

手性药物的研究越来越受到重视，不同分析方法都具备各自的优势，但也存在一些不足。例如HPLC法虽然是目前常用的方法但其手性固定相的成本太高，手性流动相添加剂使色谱条件变得较复杂；而GC法在药物分析中对药物的沸点要求严格，且其非对映体制备较困难等。为了弥补单一技术的不足，各种分离技术的联合使用越来越多，在未来手性药物拆分中将会发挥越来越显著的作用。

[1] 张怡评，洪 专，方 华，等. 超临界流体色谱分离技术应用研究进展[J]. 中医药导报，2012，18（7）：89-91.

[2] 陈立云，张晓峰，曾玉玲，等. 高效液相色谱法测定安立生坦中对映异构体[J]. 药物分析杂志，2015，（8）：1471-1473.

[3] 王利娜，乔艳丽，赵锦花. HPLC法测定左舒必利的手性杂质[J].药物分析杂志，2015，（3）：464-466.

[4] 郑 振，陈秀娟，赵 亮，等. 衍生化β-环糊精手性固定相高效液相色谱法拆分米那普仑对映体及其分离机制[J]. 色谱，2017，35（3）：286-290.

[5] 付小帅，郭雯雯，姜 珍，等. 基于正交设计的毛细管电泳法分离尼卡地平等5种手性药物对映体[J]. 沈阳药科大学学报，2013，（5）：351-355.

[6] 董树清，王利涛，张 霞，等. 超支化聚合物开管毛细管电泳技术分离手性药物[A]. 中国化学会第六届全国分子手性学术研讨会论文集[C]. 北京：中国化学会，2014.

[7] 孙嘉仪，邢玉平，宋佳新，等. 毛细管电泳法分离4种手性药物对映体[J]. 沈阳药科大学学报，2015，32（3）：199-203.

[8] 左莉华，孙 志，郭兴杰，等. 高效毛细管电泳法拆分5种手性药物[J]. 中国医院药学杂志，2016，36（12）：983-988.

[9] 傅 强，罗智敏，郭鹏琦. 分子印迹技术及其在药物分离与分析中的应用[J]. 西安交通大学学报（医学版），2016，37（6）：765-775.

[10] 邴乃慈，田 震，朱路平，等. 中空纤维分子印迹复合膜选择性分离萘普生对映体[J]. 上海第二工业大学学报，2012，（2）：92-97.

[11] 赵 潇，秦培勇. 布洛芬手性拆分分子印迹复合膜的制备与表征[J]. 北京化工大学学报（自然科学版），2013，40（1）：5-9.

[12] Tong S Q，Guan Y X，Yan J Z，et al. Enantiomeric separation of （R，S）-naproxen by recycling high speed counter-current chromatography with hydroxypropyl-β-cyclodextrin as chiral selector[J]. Journal of Chromatography A，2011，1218（32）：5434-5440.

[13] 沈芒芒. 手性配体交换逆流色谱拆分芳香性α-羟基酸衍生物[D].杭州：浙江工业大学，2016.

[14] 谢 娜. 高速逆流色谱拆分酮康唑等三种手性药物的研究[D]. 湘潭：湘潭大学，2016.

[15] Klesper E，Corwin A H，Turner D A，et al. High pressure gaschromatography above critical temperatures[J]. J Org Chem，1962，（27）：700-701.

[16] 戴 涛，黄珺珺，季 红，等. 超临界流体色谱拆分齐留通对映体[J].华西药学杂志，2012，27（1）：67-69.

[17] 金 薇，杨新磊，陆 丹，等. 超临界流体色谱法手性拆分左乙拉西坦及其右旋异构体[J]. 药物分析杂志，2013，（5）：822-826.

[18] Chennuru L N，Choppari T，Duvvuri S，et al. Enantiomeric separation of proton pump inhibitors on new generation chiral columns using LC and supercritical fluid chromatography[J]. Journal of Separation Science，2013，36（18）：3004-3010.

[19] 尹文娟，樊 榕，何超群，等. 脂肪酶在高血压手性药物合成中的应用[J]. 江西化工，2014，（3）：38-40.

[20] 傅德进，郑仁朝，郑裕国. 摩氏摩根菌产酯酶条件优化及在普瑞巴林手性中间体合成中的应用[J]. 生物加工过程，2012，10（6）：12-17.

[21] 于 芳，郭栋才，于海洋，等. 生物酰化酶Ι（acylaseΙ）对溴代苯丙氨酸手性拆分的研究[J]. 当代化工，2015，（2）：221-223.

[22] 张之建，李鸣海，张耀华，等. 脂肪酶Novozyme435手性拆分（R，S）-扁桃酸[J]. 国外医药抗生素分册，2016，37（2）：81-83.

Advances in Analytical Methods of Chiral Drugs

ZHONG Chun-su1，YANG Hua2
（1. Biosience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC; 2. Demonstration Center of Plant Science Experiment Teaching , Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

Based on the concept of chiral drugs, the principle, characteristics and research examples of several kinds of commonly used chiral pharmaceutical analysis technology were reviewed, which includes high-performance liquid chromatography (HPLC), capillary electrophoresis (CE), molecular imprinting technology(MIT), high-speed counter-current chromatography (HSCCC), supercritical fluid chromatography (SFC) and enzymatic method. All these may provide guidance for chiral drug separation technology.

chiral drug; separation; chromatography; research progress

R914.1

A

1006-060X（2017）11-0113-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.011.031

2017-09-13

湖南省科技计划项目（2015RS4059）

钟春素（1995-），女，广东河源市人，本科生，生物工程专业。

杨 华

（责任编辑：成 平）