王慧静　谢旺凯　王俭　肖兰兰　计苏慧　薛向阳　董海艳　王乐丹　陈向敏

【摘要】 目的：比較宫颈组织人乳头瘤病毒16亚型中HPV早期基因（E6/E7）和晚期基因（L1）的检出情况，并分析其作为宫颈癌及癌前病变评价的意义。方法：选择高危型（HR）-HPV16亚型的E6/E7区基因和HR-HPV的L1区基因设计特异性引物，优化条件，建立高危型HPV16分型检测方法。分别收集宫颈组织慢性宫颈炎22例，宫颈上皮内瘤变、宫颈鳞癌54例共76例组织标本，根据病理学诊断结果分为两组，对照组（慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变（CINⅠ级）和高级别宫颈病变组（CINⅡ级、CIN Ⅲ级、宫颈鳞癌），抽提DNA，采用新建立的方法对HPV早、晚期基因进行PCR检测，同时与临床的杂交捕获二代法（HCⅡ）检测的HPV L1基因进行比较。结果：成功建立了敏感、特异的基于E6/E7和L1基因的PCR检测方法，E6/E7基因HPV16分型检测阳性率为55.3%（42/76），HPV L1和HCⅡ-HPV L1检测阳性率均为25.0%（19/76），E6/E7基因阳性率明显高于HPV L1和HCⅡ-HPV L1，差异有统计学意义（P<0.01）；而HPV L1和HCⅡ-HPV L1基因阳性率的差异无统计学意义（P>0.05）。对照组的HPV E6/E7、HPV L1和HCⅡ-HPV L1阳性率分别为29.0%、9.7%和12.9%，显著低于高级别宫颈病变组的73.3%、35.6%和33.3%（P<0.05）。HPV早期基因（E6/E7）与晚期基因（L1）检测结果关联性分析，对照组HPV E6/E7与HPV L1的检测结果有关联（P<0.05）；高级别宫颈病变组HPV E6/E7与HPV L1的检测结果有关联（P<0.01）；其余检测结果均没有关联（P>0.05）。结论：HPV E6/E7基因比L1基因检测更具灵敏、高效、实用的特点，将E6/E7基因HPV16亚型阳性检测结果与CINⅡ以上病理诊断结果相结合，可作为预测评价临床早期宫颈病变及宫颈癌的有效方法之一。

【关键词】 人乳头瘤病毒16亚型； E6/E7基因； L1基因； 聚合酶链式反应

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2016.36.003 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2016）36-0005-04

Comparison and Significance of the DNA Detection of E6/E7 Gene and L1 Gene in HPV/WANG Hui-jing，XIE Wang-kai，WANG Jian，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2016，14（36）：5-8

【Abstract】 Objective：To compare the situation of the HPV16 subtype detection of the early gene（E6/E7） and the later gene（L1） in cervical tissue and analyze the significance in evaluating cervical cancer and cervical precancerosis.Method：The E6/E7 gene and the L1 gene of high risk HPV16 subtype were chosen and designed specific primers.Then PCR conditions were optimized and the new PCR detective method of high-risk HPV16 was established.76 cases of cervical tissues established were collected，which including 22 cases of chronic cervicitis and 54 cases of cervical intraepithelial neoplasias（CIN） and crervical squamous carcinoma.According to pathological diagnosis results，they were divided into two groups including control group（chronic cervicitis and CINⅠ） and high-grade cervical lesion group（CINⅡ，CINⅢ，crervical squamous carcinoma），and DNA was extracted and detected by new established method of E6/E7 gene PCR and HPV-L1 gene PCR.Then the detecting result was compared with clinical detecting method of HCⅡ.Result：A sensitive and specific PCR detective method based on E6/E7 gene and L1 gene for high-risk HPV16 type were established successfully.The positive rate of HPV E6/E7 PCR method of tissues was 55.3%（42/76），the positive rates were both 25.0%（19/76） with HPV L1 gene PCR method and HPV L1 HCⅡ method.The positive rate of HPV E6/E7 PCR method was obviously higher than other methods，and the difference was statistically significant（P<0.01）.But the positive rates between HPV L1 gene PCR method and HPV- L1 HCⅡmethod was not statistically significant（P>0.05）.The positive rate of HPV E6/E7，HPV L1 and HPV- L1 HCⅡ in the control group was respectively 29.0%，9.7% and 12.9%，which were respectively obviously lower than the positive rate of 73.3%，35.6% and 33.3% in high-grade cervical lesion group（P<0.05）.The detection result about relevance between the early gene（E6/E7） and the late gene（L1） was analyzed，the result showed that HPV E6/E7 and HPV L1 were both related in the control group（P<0.05） and in high-grade cervical lesion group（P<0.05），but the others were not related（P>0.05）.Conclusion：The E6/E7 gene detection is more sensitive，more efficient，more pragmatic than L1 gene.Combining the positive detection results of HPV16 E6/E7 gene with the pathological diagnosis above CINⅡ class can be one of practical methods of predicting and evaluating the early clinical cervical lesion and cervical cancer.

【Key words】 HPV16 subtype； E6/E7 gene； L1 gene； Polymerase chain reaction

First-authors address：Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China

宫颈癌是女性最常见恶性肿瘤之一，近年来随着宫颈癌防治工作的发展，宫颈癌的发生率和死亡率呈现下降的趋势，但它仍是导致女性死亡的最常见病因之一。已经证实，持续性高危型HPV感染是诱发宫颈肿瘤的病因[1]。目前唯一通过美国FDA认证的广泛应用于临床的杂交捕获二代法，通过DNA和特异的RNA探针杂交，主要根据L1衣壳蛋白基因来判断是否有HPV感染，但L1晚期基因在病毒基因整合过程中常发生断裂丢失[2]，这严重限制了基于L1基因的临床检测效果。而HPV E6/E7早期基因在基因整合过程中持续存在于HPV基因组中，因此HPV E6/E7基因被认为是宫颈癌检测的更可靠的持续性存在的靶点[3]。因此通过该基因早期预测宫颈病变和疾病进展，从而降低其发生率和死亡率具有临床意义。鉴于国内还未见HPV早期基因E6/E7与晚期基因L1检测比较的研究报道，本研究以HPV16型别为基础，选择E6/E7基因和L1基因设计特异性引物，建立一种新型的PCR检测方法，对76例宫颈组织进行高危型HPV16早期基因（E6/E7）和HPV晚期基因（L1）的检测，同时结合宫颈组织的病理诊断结果分析比较，评价临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2010年12月-2012年4月采自温州医科大学附属第一医院和附属第二医院的妇产科患者宫颈组织，经病理确诊慢性宫颈炎22例、宫颈上皮内瘤变（CIN） Ⅰ级9例、CIN Ⅱ级18例、CIN Ⅲ级17例、宫颈鳞癌10例，共76例；根据组织样本的病理学诊断结果将76例样本分为两组，对照组（慢性宫颈炎、CIN Ⅰ级）31例，高级别宫颈病变组（CIN Ⅱ级、CIN Ⅲ级、宫颈鳞癌）45例。其中医院通过杂交捕获二代法（HCⅡ）检测HPV L1阳性为19例。患者年龄最小25岁，最大69岁，平均41岁。所有标本征得患者及家属同意并签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器

HPV16型核酸扩增检测系统，包括TIANGEN 2×Taq PCR MasterMix（KT201）；TIANGEN TIANgel Midi Purification Kit（DP209-2）；TIANGEN TIANamp Genomic DNA Kit（DP304）；SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus Code（No.QPK-212T，212，212X5）；Thermal EPR116 PCR仪[赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司]；HPV16阳性的Siha细胞和HPV18阳性的Hela细胞由微生物学与免疫学实验室保存。

1.3 方法

1.3.1 提取宫颈组织和细胞株DNA 取细胞悬液，1000 r/min离心5 min，用基因组提取试剂盒（DP304）提取细胞DNA，同时提取76例宫颈组织，并按试剂盒中的操作步骤进行，最后将DNA浓度统一稀释成100 ng/?l后，放于-30 ℃保存备用。

1.3.2 引物的设计及合成 通过NCBI查找HPV E6/E7的基因序列，分析同源性，利用Primer 6.0及Oligo 7.0软件设计HPV16型特异引物，参考有关文献[4]获取HPV L1通用引物GP5+/6+的序列引物。由上海生工生物工程有限公司合成如下引物：HPV16 E6/E7区（209 bp），前向引物为5-GTGGACCGGTCGATGTATGTCT-3，反向引物为5-TCCGGTTCTGCTTGTCCAGC-3；HPV L1区（146 bp），前向引物为5-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3，反向引物为5-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3。

1.3.3 多聚酶链反应（PCR） 在25 μl反應体系中依次加入灭菌双蒸水5.5 μl，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μl，两条引物各1 μl，样本DNA 5 μl进行扩增。扩增条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s；57 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；循环35次；72 ℃后延伸5 min。

1.3.4 PCR产物琼脂糖凝胶电泳 取PCR扩增产物10 μl进行1%琼脂糖凝胶（含有0.1 μl/ml的Gelred染料）电泳并在凝胶成像分析仪观察。若在209 bp处出现DNA明亮条带，且与感染HPV16型的Siha细胞DNA电泳结果一致，表明HPV16型DNA阳性。同时平行进行HPV L1基因引物PCR的检测方法，PCR产物经电泳分析后测序验证。

1.3.5 HPV E6/E7基因PCR检测方法敏感性试验 将HPV16阳性的DNA模板进行系列10倍稀释后行基于HPV16 E6/E7基因的PCR检测。

1.4 统计学处理

采用PASW 18.0软件对试验数据进行统计学分析，计数资料以率（%）表示，成组设计两个率的比较以及2×2列联表关联性分析，采用Pearson 字2检验、四格表校正字2检验或Fisher 确切概率法；3个率比较采用Pearson 字2检验，随后的两两比较采用字2分割法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV E6/E7和HPV L1分型检测方法的建立

（1）以明确HPV16感染的宫颈组织及Siha细胞（HPV16+）作为阳性模板，通过设计HPV16亚型的E6/E7早期基因特异性引物和L1晚期基因通用引物，优化PCR条件，建立了HR-HPV PCR检测方法。结果发现，该方法能特异检测到HPV早、晚期基因，其产物分别为209 bp和146 bp（图1、图2）。（2）敏感性试验结果显示，DNA模板量低至0.01 ng仍能扩增特异目的片段（图3）。表明该分型检测方法成功建立。

图1 HPV16 E6/E7阳性标准电泳图

注：M：D2000 Marker；泳道1：Siha细胞；泳道2：Hela细胞；泳道3：明確HPV16感染的宫颈组织

图2 HPV16 L1阳性标准电泳图

注：M：D1000 Marker；泳道1：Siha 细胞；泳道2：Hela细胞

图3 HPV16 E6/E7早期基因PCR检测敏感性分析

注：M：D2000 Marker；泳道1～5分别为100、10、1、0.1、0.01 ng DNA模板量

2.2 HPV E6/E7和HPV L1基因阳性检出结果

76例宫颈组织平行进行前述的HPV E6/E7和HPV L1 DNA检测，PCR检测结果发现，HPV E6/E7基因检出阳性率55.3%；HPV L1基因检出阳性率为25.0%；HCⅡ-HPV L1基因检出阳性率为25.0%；三种基因阳性率比较差异有统计学意义（字2=20.374，P=0.002），而HPV L1和HCⅡ-HPV L1阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.3 不同病理学分级HPV早、晚期基因阳性率比较

在宫颈病变患者中，对照组的HPV E6/E7阳性率为29.0%，显著低于高级别宫颈病变组的73.3%（P<0.01），对照组的HPV L1阳性率为9.7%，显著低于高级别宫颈病变组35.6%（P<0.01），对照组的HCⅡ-HPV L1阳性率为12.9%，显著低于高级别宫颈病变组的33.3%（P<0.05），见表2。

2.4 不同病理分级中HPV E6/E7与HPV L1和HCⅡ-HPV L1检测结果关联性分析

根据HPV早期基因与HPV晚期基因检测结果关联性分析：（1）对照组HPV E6/E7与HPV L1检测结果具有关联性（P=0.019）；（2）高级别宫颈病变组HPV E6/E7与HPV L1检测结果具有关联性（字2=7.036，P=0.008）；（3）在对照组和高级别宫颈病变组中，HPV E6/E7与HCⅡ-HPV L1检测结果都没有关联性（用四表校正字2值，分别为：字2=2.497，P=0.114；字2=3.196，P=0.074），见表3。

3 讨论

尽管近年来宫颈癌的死亡率呈现一定的下降趋势，但早期宫颈癌的预防仍是人类关注的研究热点之一。高危型HPV的持续性感染是宫颈癌发病的重要因素，已证实超过2/3的宫颈癌发病与HPV16型或18型等高危型的持续感染相关，且宫颈组织的病变程度与HR-HPV的早期基因DNA和mRNA的表达呈现一定的相关性[5]。目前临床上主要通过细胞形态学检测、病理组织检测诊断宫颈组织病变，均为有创性操作，且作为常规筛查手段易造成大量的资源浪费。

本研究设计的HPV16 E6/E7特异性引物，在优化条件后建立的HPV16的PCR检测方法具有高度特异性与灵敏度，检测的HPV16早期基因E6/E7阳性率明显高于HPV L1晚期基因，与文献[5-6]报道一致，表明早期基因E6/E7在致癌过程中始终呈持续高表达；而L1晚期基因的检出率明显低于E6/E7基因，与临床检测的HCⅡ-HPV L1基因检出率基本相同，这可能是HPV-DNA整合到宿主细胞DNA后导致L1晚期基因缺失，而使L1基因呈阴性表达[7]。在不同的病理组织学分级患者中，结果显示对照组和高级别宫颈病变组HPV的阳性率随着病理级别的升高呈上升趋势，差异有统计学意义（P<0.05），提示HPV16的阳性率与病变程度有关。另外HPV早、晚期基因检测结果关联性分析显示在两组不同的病理分级中HPV E6/E7与HPV L1检测结果有关联，提示HPV E6/E7与HPV L1联合检测，可以更全面地评估宫颈病变风险，提高宫颈病变诊断准确率。而HPV E6/E7与HCⅡ-HPV L1结果无关联，可能与其采用HCⅡ法检测有关。可见这种新的基于HPV E6/E7的高危型HPV16的检测方法在筛查高级别宫颈病变方面有优势，提示当患者宫颈组织高危型HPV16检测为阳性时，病理组织学活检为CIN Ⅱ、Ⅲ级及宫颈鳞癌时应引起高度警惕。有报道高危型HPV的早期蛋白E6、E7在宫颈肿瘤的发生过程中起着重要作用[8-9]，且在宫颈癌中持续存在[10]，本研究结果也证实了早期基因E6/E7 DNA表达明显高于晚期基因L1 DNA的表达，并且相较于L1基因，选择HPV E6/E7早期基因进行检测，检出率更高。因此HPV E6/E7基因是作为检测高危型HPV更为可靠的靶基因，新建立的基于E6/E7基因检测HPV的方法可用于临床筛查癌前病变及宫颈癌。

综上所述，基于早期基因E6/E7的DNA检测与晚期基因L1 DNA及HCⅡ杂交捕获法L1检测比较，E6/E7的DNA检测法是更具特异、灵敏、高效、实用的一种新的检测方法，且具有操作简便，检测成本低等特点，较临床主流的HCⅡ杂交捕获法更有优势，将其应用于临床进行宫颈癌HPV筛查，更具应用价值和临床意义。通过比较高危型HPV早期基因与晚期基因的差异性表达，结合临床病理组织学诊断标准，可更有效地筛查出潜在的高度宫颈病变人群，进行早发现、早干预和早治疗，以降低宫颈肿瘤的发生率和死亡率。

参考文献

[1]黄斌，李瑞珍，吴瑞芳，等.HPV L1壳蛋白与hTERC基因检测及联合分析对宫颈癌筛查的意义[J].华中科技大学学报（医学版），2010，39（4）：554-557.

[2]郝敏，卞美璐.人乳头瘤病毒L1蛋白功能及其临床应用[J].中国实用妇科与产科杂志，2010，26（5）：352-355.

[3]高国兰，韩洁，聂春莲.HPV16 E6 E7 siRNA作用于人宫颈癌细胞株的实验研究[J].中国肿瘤与临床，2008，35（21）：1236-1240.

[4] Feoli-Fonseca J C，Oligny L L，Brochu P，et al.Human papillomavirus （HPV） study of 691 pathological specimens from Quebec by PCR-direct sequencing approach [J].Journal of Medical Virology，2001，63（4）：284-292.

[5]劉甚佳，尹利荣，李洪林.高危型HPV感染宫颈病变中E6/E7 mRNA 的表达水平[J].天津医药，2015，43（2）：186-188.

[6] Liu T Y，Xie R，Luo L，et al.Diagnostic validity of human papillomavirus E6/E7 mRNA test in cervical cytologicalsamples[J].J Virol Methods，2014，196（2）：120-125.

[7] Hilfrich R，Hariri J.Prognostic relevance of human papillomavirus L1 capsid protein detection within mild and moderate dysplastic lesions of the cervix uteri in combination with p16 biomarker[J].Anal Quant Cytol Histol，2008，30（2）：78-82.

[8] Sanclemente G，Gill D K.Human papillomavirus molecular biology and pathogenesis[J].J Eur Acad Dermatol Venereol，2002，16（3）：231-240.

[9] Wang J，Sampath A，Raychaudhuri P，et al.Both Rb and E7 are regulated by the ubiquitin proteasome pathway in HPV-containing cervical tumor cells[J].Oncogene，2001，20（34）：4740-4749.

[10]杨红杰，李忻琳.宫颈癌病因及预防[J].医学与哲学，2011，32（7）：74-75.

（收稿日期：2016-08-19）