孟丽华，史艳伟，时兵，孟娟，蒋帮铜，吴广州

(济宁市渔业监测站，山东 济宁 272000)

四环素类抗生素残留的检测方法及其对渔业环境的影响研究进展

孟丽华*，史艳伟，时兵，孟娟，蒋帮铜，吴广州

(济宁市渔业监测站，山东 济宁 272000)

近年来四环素类抗生素在水产品和渔业环境中残留污染已引起广泛关注。文章对水产品中四环素类抗生素残留的前处理方法及仪器检测方法等研究进展进行综述，同时详细介绍了四环素类抗生素对渔业环境的影响，以期为渔业水质中四环素类抗生素残留检测方法的开发及限量标准的制定提供参考。[中国渔业质量与标准，2017,7(1):50-55]

四环素类抗生素；残留；检测方法；渔业环境；水产品；前处理

四环素类(tetracyclines, TCs)是一类由放线菌产生的、化学结构属于氢化并四苯环衍生物的抗生素，可分为天然品和半合成品两大类，其中最常使用的是金霉素(chlortetracycline, CTC)、土霉素(oxytetracycline, OTC)、强力霉素(doxycycline, DC)和四环素(tetracycline, TC)。四环素类为广谱抗菌药，具有抗菌或抑菌的功效，因其价格便宜且在防治肠道感染和促进生长方面具有显著作用，被用于畜禽饲料添加剂和药品中，在水产养殖中主要用于防治鱼类肠炎病、赤皮病、烂鳃病和白头白嘴病等[1]。

研究发现，养殖鱼类只能吸收一部分的四环素类抗生素，相当一部分则以原药或代谢物的形式随排泄物排入到养殖水体中，从而在渔业环境中蓄积[2]。四环素类抗生素通过对水产品和养殖水体的直接污染或通过食物链传递到动物源食品中，对人类的健康和生存造成不利的影响[2]。四环素类药物残留达到一定量后，可对胃肠、肝脏造成损害及使牙齿染色等，还会造成过敏反应，二重感染后，具有致畸致癌作用，因此被许多国家列为限量药物[3]。可见，四环素类抗生素在水产品及养殖环境中残留问题研究已非常必要。目前检测水产品中四环素类残留的标准主要有国家标准GB/T 20764—2006《可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-紫外检测法》[4]、GB/T 21317—2007《动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法与高效液相色谱法》[5]和行业标准SC/T 3015—2002 《水产品中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定》[6]及浙江地标DB 33T 691—2008 《水产品中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定》[7]。渔业环境中四环素残留检测还未出台相应的标准，相应的检测方法研究也较少[2]。

文章主要对水产品中四环素类抗生素的前处理、检测分析方法及对渔业环境的影响研究进展进行了综述，以期为渔业水质中四环素类抗生素残留检测方法的开发及限量标准的制定提供参考。

1 水产品中四环素类抗生素残留检测的前处理方法

样品的前处理包括样品提取和样品净化两大步骤，是将待测样品处理成适合测定的检测溶液的过程，是检测过程中关键的一部分，影响检测结果的准确度、精密度和回收率。因此，样品前处理技术的优化是目前兽药残留分析研究的难点和热点之一。

1.1 样品的提取

提取是指根据残留药物与样品基质的物理化学特性差异，采用适当的溶剂将待测物从样品基质中提取分离出来。因此溶剂的选择，决定着提取的效果。在弱酸性溶液中四环素类药物相对稳定，由于其易与金属离子和生物样本中的蛋白质发生络合，所以提取四环素类残留时需要在弱酸性条件下加入金属络合剂和去蛋白剂。常用的溶剂有Mcllvaine Buffer EDTA缓冲液[8]、高氯酸[9]、醋酸铵缓冲液[10]、柠檬酸缓冲液[11]、Na2EDTA-柠檬酸缓冲液[12]、乙酸、乙酸镁和EDTA混合液[13]、草酸甲醇溶液[14]、二氯甲烷[15]等。不同的提取剂对水产品中4种抗生素回收率详见表1。由表1可以看出，高氯酸、磷酸、草酸、乙酸等提取液的优点是蛋白质易沉淀、杂质少，但有的抗生素的回收率偏低，现倾向于用Na2EDTA-柠檬酸缓冲液代替，既提供金属络合剂又提供酸性环境，还提高提取率。

表1 提取剂对水产品中四环素类抗生素回收率的影响

1.2 样品的净化

净化是指通过物理或化学的方法将提取液中的干扰物质去除的过程，主要是利用待测物与干扰物的理化特性的差异，将干扰物的量减少到能正常检测目标残留物的水平，是四环素类抗生素精确测量的前提。水产品中四环素类抗生素残留分析常用的净化方法主要液液萃取法[17-18]、固相萃取法[8-16]、基质固相分散法[19]和固相微萃取法[20]。

液液萃取主要是利用待测物与其他杂质在萃取液中溶解度的不同而进行提取的一种方法，方法简单方便，适合于简单样品的分离，对于复杂样品需要进一步净化和富集。马瑞欣等[17]用甲醇-水-甲酸(80 ∶20 ∶0.3，V/V)和含0.3%甲酸的甲醇溶液两步提取，减压蒸馏，高效液相色谱分析，土霉素回收率75.9%～116.2%，四环素回收率67.87%～102.2%，金霉素回收率43.78%～84.17%。基体分散固相萃取法将固相萃取材料与样品一起研磨后，将混合物填料装柱，然后淋洗，是集样品均化、提取、净化于一体的方法。赖克强等[19]采用基质固相分散法将鱼肉与C18填料研磨混合均匀后上柱，先用正己烷淋洗，再用二氯甲烷洗脱，旋转，定容后高效液相色谱测定，平均加标回收率为73.2%～92.3%。固相微萃取是基于待测物在固定相和水相之间的平衡分配基础，集采样、萃取、浓缩、进样于一体的分离方法，具有简单、便携、低廉的特点。Wen等[20]通过固相微萃取和高效液相色谱联用技术，测得四环素、土霉素、金霉素、强力霉素的最低检出限分别为22、16、30、21 ng/g。

水产品中四环素类抗生素类药残净化最常用的是固相萃取柱，包括C18柱、HLB柱、PCX柱等。林荆等[21]采用固相萃取HLB柱净化方法，同时净化鳗中的6种四环素类药物，经甲醇洗脱、氮吹吹干定容后，然后进行超高效液相色谱-串联质谱法分析，回收率为61%～97%，该方法操作简单、萃取效率高，具有广泛的通用性，适用于大多数水产品的处理净化。程雪梅等[22]采用C18柱净化方法提取虾中的4种四环素类药物，经4%甲酸甲醇溶液洗脱，氮吹浓缩定容后，经高效液相色谱-串联质谱法分析，平均回收率为50.2%～91.2%，检出限为2～8 μg/kg(S/N=3)；李小玲等[10]采用PCX柱净化水产品中四环素类抗生素及盐酸克伦特罗药物残留，用NH3·H2O-乙酸乙酯混合液洗脱，回收率为64.3%～100.6%；黄志勇等[23]直接将提取液氮吹浓缩定容后，过0.45 μm滤膜后直接进高效液相色谱检测，与其他前处理方法相比，该方法具有简单、快速的特点。

2 水产品中四环素类抗生素残留的检测方法

水产品中四环素类抗生素残留检测以仪器检测和免疫学检测法为主，常见的仪器检测方法有高效液相色谱-紫外检测法[24-27]、高效液相色谱-荧光检测法[28-30]、高效液相色谱柱前衍生-荧光检测法[31]、超高效液相色谱法[32-33]、液相色谱-串联质谱法[34-35]、超高效液相色谱-串联质谱法[36]和毛细管电泳法[37]；免疫学检测法主要有酶联免疫测定法、荧光免疫测定法、胶体金免疫层析法和放射性免疫法[38-40]；此外还有微生物法[41]等。

目前水产品中四环素类抗生素残留检测最常用的方法是高效液相色谱法。刘丽等[42]建立高效液相色谱-紫外法测定水产品中的土霉素、四环素、金霉素，结果为土霉素、四环素和金霉素的检出限分别为0.010、0.008和0.035 mg/kg，加标回收率为85%～120%。王萍亚等[11]则用高效液相色谱(HPLC)-荧光法同时测定水产品中4种四环素药物残留，土霉素和四环素的检出限为0.01 mg/kg，金霉素和强力霉素的检出限为0.03 mg/kg，添加平均回收率80%～10%。郑洁[31]采用柱前衍生化的方法，将四环素类抗生素定量转化为强荧光的衍生物，然后进行HPLC分离和荧光检测，结果表明，柱前衍生四环素类抗生素的HPLC分离-荧光检测法比天然四环素类抗生素的HPLC-荧光检测法的检出限提高103～105。随着超高效液相色谱的出现，贝亦江等[32]利用超高效液相色谱仪检测水产品中金霉素、土霉素、四环素的药物残留，实验结果证明，使用UPLC检测分析，缩短了分析时间，提高了检测的灵敏度。

液相色谱-串联质谱法是所有检测方法中提供信息量最多的一种检测方法，既可准确定量，又可定性。刘艳萍等[16]建立了高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中的四环素、土霉素、金霉素和强力霉素，4种物质定量下限均可达到2.0 μg/kg，该方法适用于水产品中四环素类抗生素多残留的同时确证检测。林荆等[21]用超高效液相色谱-串联质谱分析方法同时测定水产品中6种四环素类药物残留，其添加回收率为61%～97%，检出限为2.5 μg/kg。液质-串联质谱法检出限低，灵敏度高，分析快速，能够有效去除假阳性干扰，特异性强，是未来兽药残留、农药残留检测确证的主要方法。

免疫法是一种前处理简单、选择性高、灵敏度高、且不需要大型仪器的方法。 Cháferpericás等[39]比较了酶联法和时间分辨荧光免疫法测定金头鲷中土霉素，两种方法测定检出限为16和0.08 μg/kg。檀尊社等[38]用胶体金免疫层析法快速测定水产样品中四环素类药物残留，仅需要5～10 min反应时间，试剂灵敏度达到100 ng/mL。郑晶等[40]应用放射性免疫分析法筛检烤鳗中的四环素族药物残留，检测限可达50 μg/kg，整个检测过程只需80 min。免疫法一般适合筛选样品，不适合精确的定量测定，并且实验过程中容易出现假阳性，试剂盒使用起来价格比较昂贵，限制了其普遍发展使用。

3 四环素类抗生素对渔业环境的影响

水产养殖过程中使用的四环素类抗生素有70%～80%都随饲料或粪便进入养殖水体或沉入底泥中，由于它们在环境中不易发生生物降解，使得该类药物在养殖水体和底泥中富集[43]，对养殖水体中的微生物、藻类植物、甲壳动物[44]和水生动物都产生了生态毒性[45]。常见的四环素对渔业环境的生态毒性见表2。

表2 四环素类药物对渔业环境的生态毒性

四环素类抗生素的主要作用是抗菌、抑菌，因此在研究四环素对渔业环境中的微生物的影响时，国内外的大量学者主要针对四环素对细菌和真菌的生态毒性开展大量研究。Backhaus等[46]通过对费氏弧菌的长达24 h生物发光抑制实验，对5大类常用抗生素的毒性进行了研究，结果表明，四环素类抗生素干扰蛋白质合成以及干扰DNA/RNA合成，对该细菌具有强毒性，半数有效浓度(EC50)值为0.025 1 mg/kg。

作为渔业生态系统中的初级生产者，藻类在维持整个生态系统的稳定性中具有非常重要的作用，渔业环境中抗生素大量富集，必然会对藻类造成影响[47-49]。四环素类药物通过抑制微藻类蛋白质合成和叶绿体的生成从而最终抑制微藻的生长。Fernández等[50]研究表明，强力霉素对绿藻的半抑制浓度为15.2 mg/L；赵素芬等[51]在室温条件下研究了不同浓度的土霉素对等鞭金藻细胞增殖和光合色素含量的影响，研究表明，在一定的浓度范围内，土霉素的浓度越大，等鞭金藻叶绿素a含量越少，从而导致藻细胞的光合作用强度下降，影响藻细胞的繁殖能力。

渔业环境中的四环素残留不仅对微生物、藻类产生毒性，对甲壳动物也有一定影响，一般来说，抗生素对水生甲壳动物产生毒性的质量浓度要比细菌和藻类高2～3个数量级。Wollenberger等[52]研究了集约化渔场常用的9种抗生素对大型淡水藻繁殖能力的影响，急性毒性实验结果表明，土霉素的48 h EC50约为1 000 mg/L，而四环素的最高无效应浓度(NOEC)为340 mg/L，一般情况下，比急性毒性水平低一个数量级浓度的抗生素才能对大型蚤的繁殖能力产生毒性作用；在慢性毒性实验中, 四环素EC50值为44. 8 mg/L，而土霉素EC50值为46. 2 mg/L。

上述研究大部分只是针对急、慢性毒性实验的直接结果，国内外学者通过急性毒性实验发现四环素类抗生素残留对鱼类生长产生不利影响。王慧珠等[53]以大型蚤、斑马鱼和鲫作为实验对象，探讨了环境中的四环素和金霉素对3种水生生物的急性毒性，实验表明，四环素对鲫和斑马鱼96 h半致死浓度(LC50)分别为322. 8和406.0 mg/L，金霉素对鲫和斑马鱼96 h LC50值分别为34.68和61.15 mg/L。根据肾细胞单细胞凝胶电泳实验可以看出在一定的浓度范围内土霉素能诱导鲫的肾细胞产生较大的DNA损伤，与阴性对照相比均有极显著性差异(P<0.01)[54]。李兆利等[55]以鲤为实验对象，得到了土霉素诱导鲤肾细胞DNA损伤的相同结果，并发现土霉素对鲤胚胎有致畸效应。四环素类药物的基因毒性可能对生物的影响更加深远。

4 小结

水产品及渔业环境中四环素类抗生素残留对动植物及人类均有不利影响，目前对水产品中抗生素残留的研究已经比较成熟，国内外学者都总结了比较合适的前处理过程和检测方法，国家和地方也出台了相应的标准，但是对渔业环境中四环素抗生素残留的研究较少，相关的研究也大都集中在四环素抗生素对渔业生态环境的毒性，对渔业环境中残留的检测方法的报道较少，目前国家也没有出台相关的标准，因此加强渔业环境中四环素抗生素残留的前处理方法和检测方法的调查研究，对渔业环境中检测方法的国家标准的建立、限量标准的制定都具有重要的意义。

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Research progress of the detection method of tetracyclines antibiotics residues and its influence on fishery environment

MENG Lihua*, SHI Yanwei, SHI Bin, MENG Juan, JIANG Bangtong, WU Guangzhou

(Jining Fishery Monitoring Station，Jining 272000，China)

The tetracyclines have been widely used in aquaculture since they were cultured and extracted. In recent years, the tetracyclines residues in aquaculture and fishery environment have drawn extensive attention. This paper summarized the pretreatment and detection method of tetracycline residues in aquatic product. In addition, the impact of tetracycline on the fishery environment was introduced in detail. This paper would lay a foundation for developing the detection method of the tetracyclines residues and setting up standards for its limit in fishery environment. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(1):50-55]

tetracyclines; residues; detection method; fishery environment;aquatic product;pretreatment

MENG Lihua, menglihua521@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.01.008

2016-11-01；接收日期：2016-11-22

山东省常规专家项目(370020120042)

孟丽华(1979-)，女，硕士研究生，中级工程师，研究方向为水产品质量安全与控制， menglihua521@163.com

S94

A

2095-1833(2017)01-0050-06