左舜宇，张天闻

(福建省海洋环境与渔业资源监测中心，福建，福州 350003)

水产品中孔雀石绿检测方法的优化

左舜宇，张天闻*

(福建省海洋环境与渔业资源监测中心，福建，福州 350003)

对水产品中孔雀石绿及隐色孔雀石绿的超高效液相色谱-串联质谱检测方法进行了优化。样品依靠缓冲盐体系将目标物质离子化后用酸性氧化铝除脂，利用乙腈提取，浓缩后过中性氧化铝小柱净化，35 ℃旋转蒸发近干，用1.00 mL 5 mmol/L乙酸铵0.1%甲酸-甲醇溶液(1 ∶1，V/V)定容，经0.22 μm滤膜过滤后上机检测，采用同位素内标法定量。方法优化后孔雀石绿和隐色孔雀石绿的线性范围为0.5～20.0 ng/mL，相关系数均为0.999 9，检出限为0.500 μg/kg,平均回收率分别为83.4%～101%和86.1%～101%，相对标准偏差(RSD，n=5)分别为3.44%～7.76%和2.28%～8.74%。该方法灵敏度高，准确性好，与现有国家标准相比，本方法减少了有机溶剂使用量、简化了前处理步骤，并且稳定了目标物质回收率。通过验证，该方法适用于水产品中孔雀石绿及隐色孔雀石绿残留的检测。[中国渔业质量与标准，2017,7(1):35-40]

水产品；孔雀石绿；隐色孔雀石绿；超高效液相色谱-串联质谱

孔雀石绿(四甲基代二氨基三苯甲烷，malachite green，MG)又名碱性绿、孔雀绿、盐基块绿和苯胺绿，极易溶于水，水溶液呈蓝绿色，是人工合成的绿色带有金属关泽的结晶体，属于三苯甲烷型的绿色染料[1-2]，曾作为工业染料广泛用于丝绸、皮革、羊毛等染色剂[3]。因其具有抗菌效果好、抗菌谱广、价格便宜、容易获得等优点，从20世纪30年代开始，就被作为驱虫剂、防腐剂、杀菌剂[4-6]用于水产品养殖中；后来还被广泛用于治疗和预防各类水生动物的鳃霉病、水霉病和小瓜虫病[7]等，尤其在治疗水霉病上具有特殊疗效；另外还被用于活鱼运输、池塘暂时养殖过程中以及环境消毒等[8-11]。MG一般以草酸盐或者氯化物的形式存在，吸附并富集在肌肉中，通过还原酶的作用很快代谢为溶脂性的隐色孔雀石绿(leucomalachite green, LMG)，其在肌肉组织中消除缓慢残留时间较长。

1992年，国外有关研究人员提出MG等物质的官能团三苯甲基可导致肝癌，被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)列为了二类致癌物，经研究表明长期食用含有MG和LMG残留的水产品，容易在体内富集引起肝、心脏、肾、眼睛、血液、脾、皮肤等脏器和组织慢性中毒[12]。但由于缺乏有效的替代物以及利益驱使，MG的违禁使用仍然时有发生。在2005年6月，英国食品标准局在英国当地超市抽检水产品时检测出MG；同年，重庆执法人员在水产交易市场查获含MG的甲鱼600多只；在2016年，5月广东省食药监局在惠州市酒店抽检的散装桂花鱼中被检测出LMG，6月香港食物环境卫生署食物安全中心在白鳝样本中验出含微量MG，同月山东省食品药品监督管理局在市区一超市所售鲫中检出MG[13-17]。

如何能快速、准确的检测孔雀石绿是当前全面开展水产品食品安全监管的内容之一。目前，通常采用GB/T 19857—2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》中推荐的方法进行检测，然而该方法专业性要求高，步骤繁琐，且回收率不稳定。本研究旨在优化建立水产品中MG及LMG的超高效液相色谱-串联质谱法，通过采用固相萃取净化，对前处理步骤进行优化研究，在保证精密度高、回收率稳定的前提下优化方法以达到快速、准确的要求。

1 材料与方法

1.1 实验试剂、耗材及仪器

乙腈(CH3CN，色谱纯)；甲醇(CH3OH，色谱纯)；二氯甲烷(CH2Cl2，色谱纯)；无水乙酸(C2H4O2，色谱纯)；乙酸铵缓冲溶液(0.1 mol/L CH3COONH4，用冰乙酸调至pH=4.5)；乙酸铵缓冲溶液(5 mmol/L CH3COONH4，用冰乙酸调至pH=4.5)；乙酸铵-甲醇溶液(5%)；阳离子交换柱(Waters，MCX，60 mg/3 mL)；盐酸羟胺溶液(HONH3Cl，0.25 g/mL)；对一甲苯磺酸溶液(p-CH3C6H4SO3H，1.0 mol/L)；中性氧化铝柱(ANPEL 1 g/3 mL)；(超纯水，电阻率为18.2 MΩ·cm，Milli-Q Gradient超纯水，美国Millipore公司)。

超高效液相色谱(Acquity UPLC，美国Waters公司)；三重四级杆串联质谱仪(AB Sciex Triple Quad 5500，美国AB公司，配有电喷雾ESI离子源)；离心机(Sigma 3K-30)；涡旋式混合器(IKA MS 3，德国IKA公司)；匀浆机(IKA T25)；pH计(Eutech pH510)；分析天平(Sartorius-SQP)；旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司)。

1.2 液相色谱-串联质谱条件

色谱柱为 Acquity UPLCTMBEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相 A为5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸 (1 ∶1,V/V)，流动相B为乙腈；流速为0.3 mL/min；柱温为40 ℃；进样量为1.0 μL；样品室温度为10 ℃；离子源为电喷雾离子源ESI；毛细管电压为3.5 kV；脱溶剂气流量为600 L/h；锥孔气流量50 L/h。采用正离子扫描方式，多反应监测模式(MRM)。液相色谱梯度洗脱条件见表1，质谱定性定量离子对信息见表2。

表1 液相色谱梯度洗脱条件

表2 目标化合物信息

1.3 实验方法

优化前实验过程参照GB/T 19857—2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》进行操作。

优化后实验过程按照以下步骤进行：称取5.00 g样品于50 mL离心管中，分别加入100 ng/mL内标溶液0.050 mL，0.100 mol/L 乙酸铵(甲酸调pH=4.50)2.00 mL，1.00 mol/L 对甲苯磺酸2.00 mL，250 mg/mL盐酸羟胺1 mL，10.0 mL 乙腈，振荡1 min后，再加入5.00 g酸性氧化铝，振荡混匀1 min，然后11 000 r/min离心5 min，取出上清液；残渣加5 mL乙腈重复溶解，振荡混匀1 min后，10 000 r/min离心5 min，合并离心上清液至另一离心管中，在该试管中加5 mL水，使用10.0 mL二氯甲烷萃取2次，振荡混匀1 min，再次10 000 r/min离心5 min，将有机相通过无水硫酸钠除水合并后取出，30 ℃旋转蒸发至干。

用2.00 mL 乙腈溶解残渣3次，溶解液转移至中性氧化铝柱(1 g/3 mL，先用乙腈润洗)，收集流出液，30 ℃旋转蒸发至干，用1.00 mL 5mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸)-甲醇(1 ∶1,V/V)溶液定容，0.22 μm滤膜过滤，供超高效液相色谱-串联质谱仪测定。

2 结果与分析

2.1 优化前方法检测结果

各取10份鳗鲡样品进行加标(MG和LMG 各10 μg)，使用国标GB/T 19857—2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》中生鲜水产品和加工水产品的方法进行实验，检测分析结果见表3、表4。

表3 使用鲜活水产品检测方法测定鲜活鳗鲡样品实验结果

表4 使用加工水产品检测方法测定鲜活鳗鲡样品实验结果

从结果可知，参照GB/T 19857—2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》方法在提取后大部分检测结果无法满足回收率要求(70%～120%)，生鲜水产品前处理方法提取效率低，方法虽然步骤简单，可是回收率偏差较大。而对加工水产品的检测方法，出现回收率普遍偏高的情况，但其回收率相对稳定，因此将其作为本次优化方法改进的基础。

2.2 方法优化

2.2.1提取过程优化

在GB/T 19857—2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》方法中，需对样品进行匀浆，在匀浆结束后损失在刀头上的样品较多，即使在用乙腈清洗刀头仍会造成样品和目标物质的损失。因此本实验将国标匀浆过程优化为使用涡旋振荡仪，在3 000 r/min下涡旋1 min，既避免了目标物的损失，又提高样品的提取速度，减少实验时间。

原国标方法使用分液漏斗进行液体分层，在振荡后有部分样品发生乳化，待分层过程等待时间长，且乳化层含水量高，不利于后续实验。本实验将分液漏斗改为用试管涡旋振荡后离心，同时将下层有机相通过无水硫酸钠除水后进行收集，避免了有机相中乙腈携带的水溶液收集到收集瓶中，影响后续实验。

2.2.2实验试剂用量优化

对有机试剂加入量进行了优化(表5)，通过减少有机试剂的用量不仅可以降低实验成本，还可以有效控制实验风险。原国标方法中乙腈与二氯甲烷的混合液比例接近2 ∶1 (V/V)会导致乙腈层与水相可能存在无法分离的情况，并且提取液中含有水相，后续浓缩过程无法完全蒸发干，将会延长实验时间且存在暴沸的风险。

表5 实验试剂使用量优化

2.2.3 净化方法优化

LMG具有很好的亲脂性，当样品基质复杂时，将不利于样品中目标物质的提取和净化。比较了常用的净化柱C18、HLB、MCX和氧化铝柱的净化效果，其中在氧化铝柱的选择上，由于酸性氧化铝小柱在用乙腈活化后对脂肪的吸附能力变弱，而碱性氧化铝在净化过程中对MG也有吸附作用，容易使目标物造成损失，所以本次实验选用中性氧化铝小柱。各类型回收率对比结果见图1。从对比结果可知中性氧化铝柱净化效果最好。

2.3 优化后方法检测结果

采用添加标准物质的方法考察方法灵敏度。参考国标GB/T 19857—2005中检出限为0.500 μg/kg，在优化方法实验条件下，以最低含量0.500 μg/kg进行加标，添加水平结果和离子色谱图见图2,方法优化后的检出限为0.500 μg/kg。通过观察总离子流图可知MG与LMG的峰形明显，出峰时间准确，响应值强，灵敏度高。

用质量浓度为0.500、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0 ng/mL的工作液绘制标准曲线，相关系数为0.999 9，可知曲线具有较好的线性相关性，线性回归方程见表6。

图1 各固相萃取柱净化效果对比(n=3)Fig.1 Thepurified effects contrast of each SPE column

图 2 0.500 μg·kg-1加标样品质谱图Fig.2 The spectrum of spiked 0.500 μg·kg-1 sample

采用优化后的方法对大黄鱼、鲤、鲈、黑鲷、草鱼、鲫、鲍、鳗鲡、锯缘青蟹和南美白对虾进行加标比对，检测结果见表7、表8。从检测结果可以看出，优化后的检测方法MG回收率在83.4%～101%，相对标准偏差(RSD，n=5)为3.44%～7.76%，LMG回收率在86.1%～101%,相对标准偏差(RSD，n=5)为2.28%～8.74%，比优化前的检测方法有了较大程度的改善，符合实际工作的需求。

表6 MG和LMG的回归方程以及相关系数

表7 水产品中MG回收率和精密度

表8 LMG回收率和精密度

3 结论

随着仪器设备和检测分析方法不断更新，样品前处理就显得尤为重要。相比国标，本研究做出了部分优化改进，有机溶剂和材料用量减少，检测成本降低，测定结果准确，MG和LMG加标回收率在83.4%～101%，相对标准偏差均小于10%。将优化后的实验方法应用于不同样品的实际检测，证明了该方法具有准确、简便、快速的优点，满足实际检测工作需求。

[1] 李宁. MG对健康的影响[J]. 国外医学(卫生分册)，2005, 32(5): 65-69.

[2] 龚朋飞，王权，陈永军. MG毒性及其检测研究进展[J].水利渔业, 2007, 27(4): 14-15.

[3] Culp S J, Beland F A，Heflich R H,et al.Mutagenicity and carcinogenicity in relation to DNA adduct formation in rats fed leucomalachite green [J], Mutat Res, 2002(506 /507): 55-63.

[4] Cambell R E, Lilley J H T, Panyawachira V, et al.Invitroscreening of novel treatments of alpha-nomyces invadans[J]. Aquac Res, 2001, 32(3): 44-45.

[5] Gouvello R L E, Pobel T, Richards R H, et al. Field efficacy of a ten days treatment of fumagillin against proliferative kidney disease in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss[J]. Aquaculture, 1999, 171: 44-49.

[6] Foster F J, Woodbury L. The use of malachite green as a fish fungicide and antiseptic [J]. Food Sci Biotechnol, 2012, 21(2): 519-524.

[7] 李池陶，徐伟，贾智英，等. 防治松浦镜鲤鱼卵水霉病药物的筛选[J].水产学杂志， 2011, 24(4): 5-7.

[8] Shivaji S, Ranjana S．Toxicological effects of malachite green[J]．Aquat Toxicol, 2004, 66(3): 319-329.

[9] 倪达书. 鱼类水霉病防治研究[J]. 农村实用科技, 1986(8): 26-26.

[10] Alderman D J. Malachite green-a review [J]. Fish Dis, 1985, 8(3): 16-18.

[11] 蔡凤英．浅谈MG的危害[J]．河南水产，2006(l): 11-12.

[12] Cha C J, Doerge D R, Cerniglia C E.Biotransformation of malachite green by the fungus cunninghamella elegans [J]. Appl Environ Microbial, 2001, 67(9): 33-35.

[13] 岳亚军, 夏伟, 游杰, 等. 液质联用法对鱼类水产品中MG的调查分析[J]. 食品安全质量检测学报, 2015(4): 11-15.

[14] 王敏娟, 聂晓玲, 程国霞, 等. 陕西省淡水鱼中MG的污染调查及居民膳食暴露评估[J]. 卫生研究, 2015(6): 9-12.

[15] 陶雁斌, 杨绍贵. 环境中MG的研究进展[J]. 四川环境, 2015(5): 6-8.

[16] 邓婕, 鲍洪波, 吉洪明, 等. 渔业领域中MG检测的研究进展[J]. 理化检验(化学分册), 2012(12)：11-13.

[17] 陶雁斌,杨绍贵. 环境中MG的研究进展[J]. 四川环境, 2015(5): 6-7.

Research on determination method of malachite green in aquatic products

ZUO Shunyu, ZHANG Tianwen*

(Fujian Marine Environment and Fishery Resources Monitoring Center, Fuzhou 350003, China)

Establish a UPLC-ESI-MS/MS method for rapid determination of malachite green (MG) and its metabolite leucomalachite green (LMG) in aquatic fingerlings with quantification. UPLC and MS/MS analytical conditions were examined and optimized by a series of experiments. The compound was oxidated by buffered salt system and acid Al2O3, and extracted by acetonitrile and dichloromethane; the concentrated liquid was purified on a neutral Al2O3solid phase extraction cartridge. All eluates were collected and evaporated to dryness. The residue was re-dissolved in 5 mmol/L ammonium acetate with 0.1% formic acid and methanol (1 ∶1,V/V), sonficated and filtered prior to UPLC analysis by isotope-labeled internal standard method. Malachite green and leucomalachite green showed good linearity over the range of 0.5 to 20.0 ng/mL with correlation coefficient of 0.999 9,the detection limit was 0.5 ng/mL,the average recoveries ranged from 83.4% to 101% and from 86.1% to 101%, with relative standard deviations from 3.44% to 7.76% and from 2.28% to 8.74%. In addition, the method showed advantages of simplicity, accuracy, sensitivity and coverage. Compared to the existing national standard，it has made some improvements in pretreatment, reduced organic reagents, shortened the step and stabled recovery experiment, and could be applied to simultaneous determination of malachite green and metabolite leucomalachite green in aquatic products. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(1):35-40]

aquatic products; malachite green; leucomalachite green; ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry

ZHANG Tianwen, zhangtw1986@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.01.006

2016-07-27；接收日期：2016-10-25

福建省社会发展引导性项目(2016Y0004)

左舜宇(1987-)，男，本科，助理工程师，研究方向为水产品质量安全，342006355@qq.com 通信作者：张天闻，工程师，研究方向为水产品质量安全，zhangtw1986@163.com

S945

A

2095-1833(2017)01-0035-06