杨伟克+唐芬芬+刘增虎

摘要：为研究琥珀蚕在高温和低温胁迫条件下，血淋巴超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性变化规律。对5龄琥珀蚕第3天幼虫分别进行38 ℃高温和4 ℃低温胁迫处理3 h，以室温26 ℃饲养作对照，在处理停止后0、3、6、9、12 h取血淋巴，测定SOD和CAT的活性变化。结果表明：38 ℃高温处理，引起琥珀蚕血淋巴SOD和CAT活性均呈现出先升高后降低趋势，在处理停止后3 h分别达到1个峰值86.30 U/mL和108.15 U/mL，随后逐渐减弱，最终与对照组持平。4 ℃低温胁迫，SOD活性也是在处理停止后3 h出现1个峰值59.30 U/mL，随即开始逐渐减弱，在12 h接近对照组；而CAT酶活性先下降，并低于对照，在3 h出现1个最低值11.09 U/mL，随后开始升高，在6 h达到1个峰值88.68 U/mL，随后再逐渐下降并接近对照。

关键词：琥珀蚕；血淋巴；低温处理；高温处理；超氧化物歧化酶；过氧化氢酶

中图分类号：S885.9；S881.2+1 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2017）01-0153-02

琥珀蚕（Antheraea assamensis）属鳞翅目（Lepidoptera）大蚕蛾科（Saturniidae）柞蚕属（Antheraea）的绢丝昆虫，是一种珍贵的野蚕资源，主要分布在印度东北部和印缅边境地区，印度人称其为姆珈蚕（muga silkworm）[1-2]。在印度，琥珀蚕未被完全驯化，目前还不能完全在室内饲养，只能在野外放养[3]。云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所于2006年在云南发现琥珀蚕，并对云南野生琥珀蚕进行人工驯化饲养，经过几年的探索，成功实现了琥珀蚕的室内驯化饲养，并对其形态特征、生物学特性及人工驯养关键技术作了相应的研究[4]。

目前对琥珀蚕的研究主要集中在生物学特征、饲养技术及茧丝性能和蚕丝蛋白等方面，至今还未见有关逆境条件下，琥珀蚕保护酶活性变化及生理生化特性的研究报道。本研究人工模拟逆境环境，对琥珀蚕5龄第3天幼虫分别进行高温和低温处理，测定其在高温和低温条件下SOD和CAT的活性变化，解析高温和低温对琥珀蚕生理生化影响的内在机理，为后续培育琥珀蚕抗逆新品种提供生理生化鉴定参考指标。

1 材料与方法

1.1 试验材料

琥珀蚕幼虫，由云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所提供，在室内26 ℃饲养至5龄第3天。

1.2 试验方法

试验分为3组；高温处理组、低温处理组与对照组。选择体型大小相近的5龄第3天琥珀蚕幼虫，分别置于38 ℃高温和4 ℃低温条件下冲击3 h，以室温26 ℃正常饲养为对照。

取样方法：分别取高温和低温冲击后0、3、6、9、12 h琥珀蚕幼虫，用脱脂棉蘸取75%乙醇进行体表消毒、晾干，冰上取已用75%乙醇消毒过的2号昆虫针刺其腹足，挤压虫体使血淋巴流出，收集到预先加有苯基硫脲的5 mL离心管中，4 ℃條件下，8 000 r/min离心5～8 min，收集上清液，用于酶活测定。每5头蚕的血淋巴收集到1个离心管为1个重复，每次取样均设3个重复，对照组同时取材。

1.3 主要试剂及仪器

SOD测试盒和CAT测试盒（江苏南京建成生物科技有限公司）；冰醋酸（上海联试化工）；Thermo Scientific BioMate 3S紫外可见分光光度计（美国）。

1.4 血淋巴保护酶活性测定

1.4.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定 按照SOD测定试剂盒操作。其原理是通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基（O-2· ），后者经氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见分光光度计于波长550 nm处测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度低于对照管的吸光度，通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。酶活定义：1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个SOD活力单位（U）。计算公式：总SOD活力（U/mL）=（D1-D2）÷D1÷50%×反应体系稀释倍数×样本测试前的稀释倍数。式中：D1指对照管的吸光度；D2指测定管的吸光度。

1.4.2 过氧化氢酶（CAT）活性的测定 参照CAT测定试剂盒操作。其原理是：过氧化氢酶（CAT）能分解H2O2生成H2O和O2，反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405 nm处测定其变化量，可计算CAT活力。酶活定义：1 mL样品1 s分解 1 μmol H2O2的量为1个活力单位。计算公式：样品CAT活力（U/mL）=（D1-D2）×271×[1/（60×取样量）]×样本测试前稀释倍数。式中：D1指对照管的吸光度；D2指测定管的吸光度；271为斜率的倒数；60为反应时间60 s。

1.4.3 数据处理及分析 采用Excel 2003进行数据处理及作图，同时利用SPSS 13.0进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 高温和低温处理琥珀蚕血淋巴SOD活性变化

经高温38 ℃和低温4 ℃处理后，在测定的时间范围内，与对照组相比，琥珀蚕血淋巴SOD活性均是先升高，在3 h达到1个峰值，随后逐渐减弱。其中38 ℃高温处理停止后，SOD活性上升较快，上升幅度也比较大；而低温4 ℃处理停止后，SOD活性上升幅度相对较弱（图1）。

2.2 高温和低温处理琥珀蚕血淋巴CAT活性变化

由图2可以看出，高温38 ℃和低温4 ℃均能引起琥珀蚕血淋巴过氧化氢酶CAT活性升高。其中38 ℃高温处理停止后，CAT酶活性在3 h达到1个峰值（最高值达到 108.15 U/mL），随后开始逐渐减弱，在12 h接近对照。而 4 ℃ 低温处理停止后，CAT酶活性在3 h出现降低，并低于对照，随后开始逐渐升高，在6 h达到1个峰值（最高值 88.68 U/mL），然后再逐渐降低至接近对照。

3 结论与讨论

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和过氧化氢酶（catalase，CAT）是昆虫体内重要的2种保护酶[5]，两者在维护生物体内自由基代谢平衡过程中发挥了重要的作用，并在一定程度上影响生物的抗逆能力[6-7]。CAT的主要功能是参与活性氧代谢过程，它可以催化H2O2分解为H2O和O2，避免羟自由基的产生，防止其进一步氧化而破坏生物大分子[8]。SOD能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，将其歧化为H2O2和O2，H2O2再经过CAT作用转化为水和氧气，从而达到清除超氧阴离子自由基的目的，维持细胞和机体的正常生理活动[9]。

在对家蚕和柞蚕等的研究表明，高温或低温胁迫均能引起蚕体自由基的过量积累，而蚕体内的SOD和CAT在清除自由基过程中发挥了重要作用[10-12]。夏润玺等测定了低温和高温条件下，柞蚕血淋巴CAT活性变化，研究结果表明，4 ℃ 低温处理柞蚕，其血淋巴CAT活性先下降，然后持续升高，并高于对照，处理时间越长，CAT上升幅度越大；用高温40、43、46 ℃分别处理柞蚕幼虫，均能引起柞蚕血淋巴CAT活性升高[10-11]。袁燕萍等比较了高温36 ℃冲击对家蚕抗氧化酶活性的影响，结果表明，高温冲击48～72 h，5龄家蚕幼虫中肠组织SOD和CAT活性均有一定程度的升高，并且随冲击时间的的延长其活性显著增加[12]。另外，吴蕾等研究了温度、光照周期和光照波长等环境因子对农业害虫西藏飞蝗抗氧化酶活性的影响，结果表明，在低温处理下，SOD和CAT活性随温度的降低均出现升高趋势，在5 ℃条件下，均显著高于对照；在高温胁迫下，各部位的SOD和CAT活性均呈现先升高后降低的现象，超过35 ℃后两者的活性呈现下降趋势，当温度升高到45 ℃时，SOD和CAT活性均低于对照[13]。

室内饲养琥珀蚕幼虫的最适温度为26～32 ℃，温度过高或过低均不利于琥珀蚕幼虫的生长发育，甚至造成死亡[14]。本研究结果表明，琥珀蚕在38 ℃高温处理停止后，相对于 26 ℃ 饲养的对照组，SOD和CAT活性均呈现出先升高的趋势，达到1个峰值，随后逐渐减弱，最终与对照组持平。在测定的时间范围内，SOD与CAT活性上升幅度均高于低温4 ℃处理组。这暗示38 ℃高温胁迫诱导蚕体产生的自由基可能高于低温4 ℃处理组，自由基浓度的持续升高，进一步引起保护酶SOD和CAT的活性升高。

低温4 ℃刺激停止后，琥珀蚕血淋巴SOD也是先出现上升趋势，随着时间的推移，逐渐下降，最终恢复到对照组酶活水平；而CAT活性先出现急剧下降，随后升高达到1个峰值后，再逐渐减弱，在12 h时接近对照。4 ℃低温刺激琥珀蚕，其CAT酶活先出现下降趋势，分析认为很有可能是低温4 ℃胁迫导致琥珀蚕机体自身营养代谢水平减弱甚至短暂失调，在一定程度上阻碍了CAT的合成。

本研究结果显示：高温38 ℃和低温4 ℃胁迫均能引起琥珀蚕血淋巴SOD和CAT活性在一定时间范围内出现先上升后减弱的趋势。保护酶SOD和CAT起清除自由基的作用，其活性随着自由基浓度的变化而变化[6]。不论是高温还是低温等逆境刺激对蚕体都会或多或少造成一定的损伤，打破正常的生理活动，引发蚕体产生过量自由基。在这种情况下，蚕体需要大量保护酶用来清除过量的自由基，维持机体正常的生命代谢活动。随着时间的推移，蚕体生理机能逐渐趋于正常，产生的自由基浓度逐渐降低，保护酶活性也开始下降，

两者最终维持一个动态平衡。

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