张 娟，彭 娟，朱立宇，李 辉

（株洲市中心医院生殖中心，湖南 株洲 412000）

现如今，冷冻胚胎移植（FET）已经成为了临床常用辅助生殖技术[1]。其不但能减少多胎妊娠以及限制新鲜周期移植胚胎数量，还能提升单次取卵周期累积妊娠概率。为受试者节省治疗费用。

解冻后的胚胎移植受多方面原因影响，例如接受移植期间激素含量较高、子宫膜厚度不符合要求等等。但其中最关键的是胚胎是否具有发育的潜能[2]。本研究全面探讨玻璃化冻融提前解冻并优选胚胎移植对移植结局的影响情况，旨意为相关学者的研究工作提供参考意见，现将具体结果汇报如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年9月～2017年10月我院生殖中心接收的357例行冻融胚胎移植术患者为研究对象。就不孕不育原因来看，女方原因为：排卵异常、输卵管阻塞、子宫内膜异位症。男方原因为少精症、无精症等。

1.2 方法

控制性超促排卵技术：该技术的实现依照我院内常规方案实施。结合病患自身情况，择取不同时间段方案开展控制性超促排卵技术治疗。超声引导条件下，开展经阴道穿刺取卵子手术，完成后，开展IVF以及ICSI处理以及胚胎培养。

冷冻胚胎选择原则：冷冻胚胎质量评分标准依照文献[3]内的说明进行，择取I-II级胚胎，次日细胞数量在2以上，3日后细胞数量5以上。碎片率在20.00%以下，符合上述条件的胚胎，进行冷冻处理。

胚胎冷冻和解冻方式：实验使用美国库克公司生产的玻璃化冷冻试剂套装为实验材料，对胚胎进行冷冻处理。将冷冻杯视为载体，冷冻按照库克公司（COOK，美国）操作说明进行。

（4）囊胚培养和评估：囊胚培养在6%CO2，5%O2的三气培养箱（COOK，美国）中进行，培养时间为 2-4 天。囊胚评级：使用文献[4-5]提出的Gardner评分系统开展相关工作。结合囊腔扩张水平，分为6个时期，详细为：1期：囊腔在总囊胚体积的1/2以下。2期：囊腔在总囊胚体积的1/2以上。3期：囊腔占据总囊胚体积4期：囊腔生长扩张，透明带菲薄。5期：少部分囊胚透明带内孵出。6期：全部囊胚孵出。

对于3-6期囊胚结合滋养层细胞质量以及细胞团开展分级，详细为：A级：细胞排列较为紧密，基数大。B级：细胞数量不多，排列相对松散。C级：观察可见细胞数量极少。滋养细胞分级情况为：A级：上皮细胞层结构紧密，细胞数量较多。B级：上皮细胞结构松散，细胞数量较少。C级：上皮细胞极为疏松。

选择3CC以上囊胚开展移植以及冷冻处理，5d后，最佳囊胚评分为4AA。冷冻胚胎标准为：受精后D5达到3cc级以上的囊胚冷冻。倘若没有取得D5标准，应当培养到6-7d后结合上述标准观察和冷冻。将评分在3BB的胚胎确定为优质胚胎。将评分在3CC以上的囊胚记为可利用囊胚。

（5）分组：1）根据胚胎解冻的时间，分为2组：提早解冻两管胚胎，18小时过夜后挑选发育的胚胎移植的为提前解冻培养过夜组（A1，n=194），当天解冻移植的为对照组（A2，n=163）。2）根据囊胚培养的胚胎来源分为3组：解冻后胚胎经过夜培养，挑选胚胎移植后剩余胚胎培养的为解冻剩余胚胎组（B1，n=194），新鲜周期冻存2管优质胚胎后剩余胚胎行囊胚培养的为鲜胚剩余胚胎组（B2，n=37），全部胚胎行囊胚培养的为全胚培养组（B3，n=183）。

（6）黄体和内膜准备步骤：在自然周期内，自女性月经10d起，开展检测工作。当主导卵泡直径达到14mm以上后,测定血清中LH值，排卵后第3d行FET。倘若主导细胞发育到16～20mm后，依旧没有测定出LH峰，则注射5000-10000U的HCG，排卵后第3天行FET。

激素代替周期内，从女性月经第3天行阴道B超及查性激素，无异常者给予口服补佳乐，当子宫内膜厚度到8mm后，可肌肉注射40-80mg的黄体酮。在肌肉注射第4天行D3的胚胎移植。

（7）妊娠确定以及随访：移植术后第14天，行血清β-HCG检测，若无妊娠，停止注射黄体酮。倘若β-HCG检查提示妊娠，则继续使用黄体酮。完成移植术后28天，经超声检查胚芽以及孕囊。确定宫内妊娠，并继续进行黄体支持直至妊娠10～12周。

1.3 统计学方法

采用SPSS20.0统计学软件进行分析，计数资料采用x2检验，计量资料采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 患者一般情况

受试者各项基线资料，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

表1 两组不孕患者基本情况比较（±s）

表1 两组不孕患者基本情况比较（±s）

组别 总周期数 年龄（岁） 不孕年限（年） Gn用量（支） 内膜厚度（mm） 基础FSH（mIU/ml）A1 194 30.98±4.66 3.34±3.12 33.58±10.36 9.86±2.62 8.53±1.64 A2 163 29.72±4.81 3.79±3.48 34.72±11.61 10.58±2.37 8.42±1.33

2.2 提前解冻与当日解冻移植结局比较

A1组与A2组优质胚胎率（85.2%，82.3%）无统计学差异，其临床妊娠率分别为56.3%、42.2%，着床率分别为46.9%、29.3%，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

表2 不同解冻时间FET结局比较

2.3 囊胚培养结果的比较

414例囊胚培养B1、B2和B3组比较比较，各组间成囊胚率，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

表3 囊胚培养结果

3 讨 论

和以往相比，我国近几年医学技术得到了迅猛发展。和既往程序冷冻技术相比，胚胎玻璃化冷冻保存技术在解冻之后，胚胎的卵裂球完整性强，胚胎复苏率高。且这种检查方式用时短，更为简单。当前这种技术已经成为了首选冷冻技术。对FET造成影响的因素有很多，其中包含病患年龄、移植子宫内膜适宜性以及胚胎质量好坏等等。综合考虑以上多种因素，冻融胚胎移植临床妊娠主要取决于解冻后胚胎发育潜在性能力[6,7]。需要提前对胚胎进行解冻处理，过夜完成培养之后，应当跟进性观察复苏之后的胚胎是否能继续生长，这一点对于评价胚胎种植来讲，有着相当重要的现实意义。国外学者[8]指出，复苏之后的卵裂球如果能够保持继续发育状态，对于子宫内膜和子宫着床的同步性更加有帮助。值得说明的是，Fauzdar A等[9]等对完成复苏之后还没有成长的胚胎开展原位杂交，证实上述胚胎存在染色体异常现象。其中仅有20.00%为二倍体。基于此，建议工作人员在胚胎在完成复苏之后，跟进性查看其生长情况。排除未能进一步生长的胚胎，留取优质样本。本实验中，提前解冻组挑选第二天能够发育到桑葚胚期的胚胎移植，临床妊娠率显著高于当天解冻胚胎移植组。这表明通过延长培养时间，尽可能挑选出具有发育潜能的胚胎，优化所移植胚胎中好的胚胎比率可以明显提高临床妊娠率。

1985年，Cohen J等就首次报道了人类囊胚的冷冻[10]。随着良好的培养体系的建立，使得囊胚移植成为可能，并且能获得更高的着床率和妊娠率。和其他方式相比，囊胚培养移植的优点主要为：第一、就当前技术而言，单从胚胎细胞团数和形态上，还无法准确评价胚胎情况，只有到达囊胚阶段，才能发现哪个胚胎个体潜能高。把卵裂期胚胎复苏处理之后，序贯培养48～96h，对其发育潜能进行观察，排除无优秀发育潜能以及遗传缺陷胚胎，择取优良胚胎移植，能全面提升冻胚复苏后移植周期种植以及妊娠率，进而实现降低多胎妊娠。

在自然条件下，处于第一阶段卵裂期胚胎应该在输卵管内完成发育，达到囊胚期之后，才能进入到子宫腔内。对卵裂期胚胎体外培养时，能减少胚胎植入后续发育和种植时间差，囊胚期胚胎和子宫内膜中的“种植窗”相互协调，这一点符合自然生殖法则，可减少异位妊娠。

多次卵裂期冻融胚胎复苏之后移植失败者，可以考虑将剩下的胚胎开展囊胚培养，后进行移植。可以挑选出具有发育潜能的胚胎，改善患者临床结局与降低医疗费用。

第四、当前，我国已经全面开放二胎政策，超过最佳生育年龄的夫妇可以将D3卵裂期胚胎进行序贯培养，直至达到单囊胚移植要求，能减少多胎妊娠风险。

虽然体外的培养环境不能完全模拟体内的环境，但能够形成囊胚的胚胎代表了该胚胎具有更高的发育潜能。挑选出优质的胚胎移植正是本研究的目的，能显著提高临床妊娠率。本研究比较了解冻后移植剩余胚胎组、全胚囊胚培养组和冻存2管优质胚胎后剩余胚胎组的成囊胚率。其中全囊胚培养组最高，冻存两管胚胎后剩余胚胎组次之，解冻剩余胚胎组最低，结果具有统计学意义。这说明解冻挑选发育到桑葚胚胚胎移植后，剩余停滞发育的胚胎可能普遍具有一定的异常，最终导致了低的成囊胚率。这说明我们提前解冻后观察胚胎的发育情况，再从中挑选发育良好的胚胎移植可以筛选出具有发育潜能的胚胎，从而提高解冻胚胎移植整体的临床妊娠率。同时，提前解冻胚胎移植可以避免全囊胚培养所面临的无囊胚形成从而无胚胎移植的风险，因为体外的培养环境还不能完全代表体内胚胎的生长环境。

综上所述，复苏D3卵裂期胚胎，经过夜培养，有卵裂球细胞生长的胚胎能够获得较高的种植率及妊娠率。采用同时解冻两管胚胎，从中挑选具有发育潜能的胚胎移植，剩余胚胎继续行囊胚培养，可以筛选出质量较好的胚胎进行抑制，是提高冻融胚胎妊娠结局的关键。

[1] 林洪波,李 蓉,钱卫平.冷冻胚胎移植周期中不同内膜准备方案对助孕结局的影响[J].生殖与避孕,2014,4:457-460．

[2] 张梦苑,陈柯屹,腊晓琳.新鲜胚胎与冷冻胚胎移植在体外受精周期中疗效比较的Meta分析[J].中国组织工程研究,2013,53:9245-9250．

[3] 陆小激,冯 云,张爱军.以胚胎质量评分预测体外受精-胚胎移植妊娠结局[J].上海医学,2006,3:169-172．

[4] 李 云,全 松.形态学低评分胚胎体外囊胚形成的相关因素及应用价值研究[J].实用妇产科杂志,2015,3:185-188．

[5] 刘艳丽,李君芳,张玉超.冻融胚胎移植周期临床结局的影响因素[J].郑州大学学报(医学版),2017,4:434-438．

[6] 郝 丽,黄元华.冻融胚胎移植前子宫内膜准备的研究新进展[J].中国优生与遗传杂志,2017,6:126-128．

[7] 李 伟,施文浩,任文娟.不同冷冻原因FET周期移植结局的分析[J].中国妇幼健康研究,2017,1:3-4．

[8] Joshi BV,Banker MR,Patel PM, Shah PB,et al.Transfer of human frozen-thawed embryos with further cleavage during culture increases pregnancy rates[J].J Hum Reprod Sci.2010,3:76-79.

[9] Fauzdar A, Sharma RK, Kumar A, Halder A,et al.A preliminary study on chromosome aneuploidy & mosaicism in early pre-implantation human embryo by fluorescence in situ hybridization[J].Indian J Med Res.2008,128:287-293.

[10] Cohen J,Simons RF,Edwards RG,et al.Pregnancies following the frozen storage of expanding human blastocysts[J].J In Vitro Fert Embryo Transf.1985,2:59-64.