陈飞宇，李澎，甘加宽，张安娜，任钧国，刘建勋

1.北京中医药大学研究生院，北京 100029；2.中国中医科学院西苑医院基础医学研究所，中药药理北京市重点实验室，北京 100091

桦木酸对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖的影响

陈飞宇1，2，李澎2，甘加宽2，张安娜2，任钧国2，刘建勋2

1.北京中医药大学研究生院，北京 100029；2.中国中医科学院西苑医院基础医学研究所，中药药理北京市重点实验室，北京 100091

目的观察桦木酸（betulinic acid，BA）对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖的影响，并从细胞生长周期和细胞凋亡两方面初步探讨其抗肝癌的作用机制。方法体外培养人肝癌HepG2肿瘤干细胞并证明其自我更新能力。CCK-8法检测40、20、10、5、2.5、1.25 μmol/L BA作用人肝癌HepG2肿瘤干细胞24、48 h的细胞活力；40、20、10、5 μmol/L BA作用人肝癌HepG2肿瘤干细胞48 h，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率。结果BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖有明显的抑制作用，并呈一定的量-效关系；BA能明显影响肿瘤干细胞周期，诱导肿瘤干细胞凋亡，40 μmol/L BA明显阻滞细胞周期于S期，且细胞凋亡率达到10.86％。结论BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖具有明显的抑制作用，其可能通过影响肿瘤干细胞周期及诱导肿瘤干细胞凋亡而发挥作用。

桦木酸；石见穿；人肝癌HepG2细胞；肿瘤干细胞；细胞凋亡

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是紧随肺癌、胃癌、食管癌之后的发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。最新数据显示，肝癌在60岁以下的男性中属发病率最高和死亡率最高的癌症[1]。由于肝癌的高复发、高转移率和化疗抗药性，治疗效果并不乐观。近年来，越来越多的学者认为彻底治愈肿瘤的有效疗法除针对肿瘤组织中的大部分肿瘤细胞，更重要的是靶向其中的肿瘤干细胞[2-3]。肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）是肿瘤组织中存在的极小部分细胞，通常处于静止状态，当受到细胞因子等影响时会导致肿瘤的发生、转移和复发，这均源于CSC拥有很强的自我更新及增殖分化的能力。我们前期以S180荷瘤小鼠、H22荷瘤小鼠为模型进行体内筛选，发现中药石见穿具有较好的抗肿瘤作用[4-5]，进一步对石见穿进行化学成分分析，发现桦木酸（betulinic acid，BA）为石见穿发挥抗肿瘤作用的主要有效成分之一。因此，本实验观察BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖的影响，并从细胞生长周期和细胞凋亡两方面初步探讨其抗肝癌的作用机制。

1 实验材料

1.1 细胞株

人肝癌HepG2细胞株，中国科学院细胞库，目录号TCHu72。

1.2 主要试剂与仪器

BA（Sigma），5-氟尿嘧啶（5-FU，海普药业），胎牛血清（Gibco），DMEM/F12+GlutaMAX-I培养基（Gibco），肝素（Sigma），B27神经细胞生长添加剂（Gibco），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，Acro Biosystem），成纤维细胞生长因子（EGF，Acro Biosystem），BSA（Sigma），青链霉素混合液（Solarbio），磷酸盐缓冲液（HyClone），0.25％胰蛋白酶、DMSO（MP Biomedicals），无酚红DMEM（Macgene），CCK-8试剂盒（Dojindo），细胞周期试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），FITC Annexin V凋亡试剂盒（BD）。MCO175型CO2培养箱（德国Galaxy公司），TH-200型显微镜（日本Olympus公司），Stnergy-4型酶标仪（美国Biotek公司），IEC-CL31R型离心机（美国Thermo Fisher公司），NAVISO型流式细胞仪（美国Bechman Coulter公司），JCSO344型高压蒸汽灭菌锅（日本Hirayama公司）。

2 实验方法

2.1 人肝癌HepG2肿瘤干细胞培养

[6-7]进行无血清培养基的制备及人肝癌HepG2肿瘤球干细胞的培养和传代。

2.1.1 无血清干细胞培养基制备 在DMEM/F12培养基中添加20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、2％ B27、4 μg/mL肝素、0.4％BSA、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。

2.1.2 细胞培养 正常培养人肝癌HepG2细胞，胰酶消化无血清培养基重悬，计数，稀释为2×103/mL，2.5 mL/孔，则5×103/孔接种于低吸附6孔板。置于37 ℃、5％CO2培养箱中培养。1 d后可观察到有悬浮细胞球形成。每3 d半量换液。

2.1.3 细胞传代 当细胞形成悬浮细胞球（约6 d），进行传代培养。将含细胞培养液悬浮细胞收集于离心管中，800 r/min离心5 min，1 mL胰酶替代物TrypLE Express消化，加胰酶时吹打几下稍等片刻，即可加PBS稀释，离心洗涤2～3次后无血清培养基重悬，再取适量加无血清培养基稀释培养。

2.2 分组和给药

正常组：DMEM培养基；对照组：DMEM培养基（含0.01％DMSO）；5-FU组：10 μg/mL 5-FU；BA各剂量组：DMSO为溶剂制备40 mmol/L BA，实验过程中以1000倍培养液稀释为40 μmol/L，同时等比对倍稀释分别得到浓度为20、10、5、2.5、1.25 μmol/L的BA培养液。

2.3 细胞自我更新能力验证

收集肿瘤干细胞，无血清培养基稀释为每毫升500个。在低吸附96孔板上每孔加入150 μL无血清培养基，并将稀释好的肿瘤干细胞2 μL/孔加入96孔板。镜下观察，选取有且仅有1个细胞的孔每日拍照记录。

2.4 细胞增殖检测

将对数生长期的人肝癌HepG2肿瘤干细胞制成1×108/L的细胞悬液，接种于低吸附96孔板，于37 ℃、5％CO2培养箱中培养，24 h后更换不含细胞因子的DMEM/F12培养基同步化使细胞处于G0期，24 h后分组处理，分别培养于BA浓度为40、20、10、5 μmol/L的无血清培养基中，每组设5个复孔，继续培养。48 h后弃上清液，PBS冲洗1遍后每孔加入配制好的CCK-8试剂120 μL，培养箱中继续孵育2 h。将显色完成的液体转移至正常96孔板中，于酶标仪波长490 nm处检测吸光度（OD）值。计算细胞抑制率。细胞抑制率（％）＝（对照孔OD值－给药孔OD值）÷对照孔OD值×100％。

2.5 细胞周期检测

将人肝癌HepG2肿瘤干细胞用胰酶替代物消化，无血清培养液重悬，计数，稀释为5×103/mL，3 mL/孔接种于6孔板中。待细胞稳定成球，将各孔悬浮细胞培养液转移至离心管中，1500 r/min离心5～10 min，吸弃原培养液，PBS冲洗1遍，加入无血清培养基进行同步化。24 h后按上述方法离心，吸弃无血清培养基，按照分组给药。药物作用48 h后，将各组细胞培养液收集到离心管中。1000×g离心3～5 min，沉淀细胞。吸除上清，加入约1 mL冰浴预冷的PBS重悬细胞，并转移至1.5 mL离心管中。再次离心沉淀细胞，弃上清，加入1 mL冰浴预冷的70％乙醇，轻轻吹打均匀，4 ℃固定，过夜。离心，沉淀细胞，弃上清液，用1 mL冰浴PBS冲洗1遍。每管细胞样品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞，37 ℃避光温浴30 min，24 h内流式细胞仪检测。

2.6 细胞凋亡检测

将人肝癌HepG2肿瘤干细胞用胰酶替代物消化，无血清培养液重悬，计数，稀释为5×103/mL，3 mL/孔接种于6孔板中。待细胞稳定成球，将各孔悬浮细胞培养液转移至离心管中，1500 r/min离心5～10 min，吸弃原培养液，PBS冲洗1遍，加入无血清培养基进行同步化。24 h后按上述方法离心，吸弃无血清培养基，按照分组给药。药物作用48 h后，将各组细胞培养液收集到离心管中，1500 r/min离心5～10 min，吸弃上清液，加入1 mL冰浴预冷的PBS冲洗细胞2次。用1×Binding Buffer缓冲液制成1×106/mL的悬液，吸取上述悬液100 μL至Falcon试管，加入FITC Annexin V和碘化丙啶染料，轻轻涡旋，室温避光放置15 min后，分别加入1×Binding Buffer缓冲液400 μL，1 h内流式细胞仪检测，严格按照凋亡试剂盒说明书进行操作。

3 统计学方法

4 结果

4.1 人肝癌HepG2肿瘤干细胞自我更新能力

选取有且仅有1个细胞的孔连续观察，第6日可看到细胞增殖，第8日细胞增殖数目明显增多。结果见图1。

图1 人肝癌HepG2肿瘤干细胞形态（×10）

4.2 桦木酸对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖的影响

与正常组比较，BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞体外增殖活力具有一定的抑制作用，随BA作用剂量增加和作用时间的延长，其抑制作用相对增强。作用24 h IC50为22.61 μmol/L，48 h IC50为18.30 μmol/L。结果见表1、表2、图2。

表1 24h各组人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖活力比较

表2 48h各组人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖活力比较

4.3 桦木酸对人肝癌HepG2肿瘤干细胞周期的影响

与正常组比较，5-FU组G1/G0期细胞显著增多、G2/M期细胞显著减少，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），40 μmol/L BA组G1/G0期和G2/M期细胞明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。结果见表3、图3。

导其凋亡。Foo J B等[15]发现，BA作为黄花第伦桃二氯甲烷提取物的主要成分，通过p53/p21通路将乳腺癌MCF-7细胞阻滞于G0/G1期。但本实验发现，低浓度BA（5～20 μmol/L）几乎对细胞周期没有影响，而对HepG2细胞的凋亡率作用显著，可见BA对HepG2肿瘤干细胞的凋亡与周期阻断并无特定联系。高浓度处理的细胞被阻滞于S期，说明BA通过S期阻断而诱导细胞凋亡，这可能是BA诱导HepG2肿瘤干细胞凋亡作用途径的一部分，而低浓度BA诱导凋亡的作用方式并未通过细胞周期阻滞实现，这与高浓度BA诱导凋亡的途径不同。因此，BA诱导HepG2干细胞的细胞凋亡可能是多途径的复杂过程，BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞的增殖抑制作用仍有待于进一步研究。

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Effects of Betulinic Acid on Proliferation of Human Liver Cancer HepG2 Cells

CHEN Fei-yu1,2,LI Peng2, GAN Jia-kuan2, ZHANG An-na2, REN Jun-guo2, LIU Jian-Xun2
(1. Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China; 2. Institute of Basic Medical Sciences of Xiyuan Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing Key Laboratory of Pharmacology of Chinese Materia Medica, Beijing 100091, China)

ObjectiveTo observe the effects of betulinic acid (BA) on proliferation of human hepatoma stem cell; To discuss its anti-cancer mechanism from the aspects of cell cycle and cell apoptosis.MethodsHepG2 stem cells were cultivated in vitro and testified the self-renewal capacity. The effects of BA in concentration of 40, 20, 10, 5, 2.5, 1.25 μmol/L on the cell vitality of cultured human liver cancer stem cells for 24 and 48 hours were measured with CCK-8 method. The human hepatoma stem cell line HepG2 was administrated by BA at concentrations of 40, 20, 10, 5 μmol/L for 48 hours, and cell cycle and apoptosis rate were measured by flow cytometry.ResultsBA could inhibit HepG2 stem cell proliferation obviously with dose-effect relationship. BA influenced cell cycle, and induced tumor stem cell apoptosis. 40 μmol/L BA blocked cell cycle in S phase, and cell apoptosis rate reached 10.86％.ConclusionBA has obvious inhibitory effects on proliferation of HepG2 liver cancer stem cell, which probably plays a part in anti-cancer by influencing cell cycle and inducing cell apoptosis.

betulinic acid; Salvia chinensis; human hepatoma cells; cancer stem cell; cell apoptosis

R285.5

A

1005-5304(2017)02-0060-05

2016-04-20）

（

2016-05-05；编辑：华强）

中国中医科学院自主选题项目（ZZ0708099）

任钧国，E-mail：reek2003@163.com

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.016