张秀丽，孟盼，向韵，雷昌，刘芳，黄丹，蔡川，蔡光先，王宇红

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410007；2.中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410007

补阳还五精简方的体外筛选及体内验证研究

张秀丽1，2，孟盼1，2，向韵1，2，雷昌1，2，刘芳1，黄丹1，2，蔡川1，2，蔡光先1，2，王宇红1，2

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410007；2.中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410007

目的筛选补阳还五精简方的最佳配伍，并进行验证。方法采用H2O2诱导建立PC12细胞氧化应激模型。考察不同浓度0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.5 mg/mL补阳还五汤对体外氧化应激模型细胞的保护作用，确定最佳作用浓度。采用正交试验设计，将补阳还五汤各单味药随机配伍分成补阳还五汤不同拆方组及对照组（仅加细胞培养基）、正常组（无H2O2和药物处理）、模型组,考察对PC12细胞的保护作用，筛选精简方，确定精简方各单味药的配伍比例，MTT法测定各组细胞存活率。采用大脑中动脉线栓法复制局灶性脑缺血模型，SD大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组和精简方高、中、低剂量组，各给药组给予相应药物灌胃，验证筛选结果。结果与其他拆方组比较，黄芪＋川芎＋地龙对PC12细胞的保护作用最佳（P＜0.05），且与补阳还五汤原方相当；与模型组比较，补阳还五汤组及精简方各剂量组均能改善模型大鼠大脑皮层梗死面积、降低脑组织水肿程度（P＜0.05），且以精简方中剂量组最佳。结论补阳还五精简方最佳配伍为黄芪、川芎、地龙，其比例为10∶3∶1。

补阳还五汤；拆方；局灶性脑缺血模型；氧化应激模型；大鼠

中国脑卒中防治报告（2015）提示，脑卒中作为我国第1位死亡原因，其造成的经济负担每年高达400亿元[1]。因此，如何有效防治脑卒中已成为当前医学研究和临床工作急需解决的难题和重要任务。临床应用补阳还五汤治疗缺血性中风及中风后遗症疗效较好。但其药味众多，药效物质基础难以明确。本实验采用H2O2诱导的PC12细胞氧化应激模型，结合正交试验设计对补阳还五汤进行体外拆方研究，筛选最佳精简方，并采用永久性局灶性脑缺血（MCAO）模型，对筛选结果进行体内验证。

1 实验材料

1.1 药物及制备

补阳还五汤（黄芪120 g，当归6 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，红花3 g，桃仁3 g，地龙3 g）和各单味药及筛选获得的精简方干浸膏均由湖南省中医药研究院中药所提供。补阳还五汤和精简方干浸膏分别相当于原药材4.5、4.7 g/g。所有药物均采用无菌水溶解，配制成一定浓度的母液，0.25 μm滤膜过滤除菌，使用时无菌PBS稀释至所需浓度。

1.2 细胞和动物

PC12细胞系（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞），高分化，长沙赢润生物技术有限公司。SPF级10周龄SD大鼠40只，雄性，体质量250～280 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK（京）2012-0001。大鼠饲养于室温（20±1）℃，湿度60％～70％，自由饮水进食，适应性喂养3 d后，进入实验状态。

1.3 主要试剂与仪器

DMEM高糖培养基（HyClone），胎牛血清（FBS，GIBCO），D-Hanks（Solarbio），胰蛋白酶（Solarbio），MTT（Sigma）。台式低温高速离心机（Eppendorf），超纯水分离系统（ELGA），超净工作台（北京东联哈尔仪器有限公司），倒置显微镜（ZEISS)，CO2培养箱（NEW BRUN-SWICK），多功能酶标仪（Thermo Scien Tific）。

2 实验方法

2.1 PC12细胞培养及体外氧化应激细胞模型的建立

（九）提高仔猪的初生重 仔猪的初生重与存活率、哺育率和断奶重密切相关，初生重大，存活率、哺育率高、断奶体重亦大，初生重1.3～1.5 kg与1.0 kg相比，前者断奶重提高2.5 kg。提高仔猪初生重应重视种猪的选择，加强妊娠母猪的饲养管理（前文已述及）。由于繁殖性状的遗传力低，可采用不同品种或品系间的杂交，以提高仔猪的初生重和生活力。

参照文献[2]方法。将PC12细胞接种于TC处理的培养瓶，采用含10％胎牛血清DEME高糖培养基培养。37 ℃、5％CO2细胞培养箱中温育，待细胞贴壁融合至90％时，0.25％胰蛋白酶消化，以1×104个/孔接种于96孔板，待细胞生长至对数生长期，替换为无血清培基继续培养12 h，再用H2O2终浓度为0.3 mmol/L无血清培养液继续培养2 h。

2.2 补阳还五汤拆方分组原则及对PC12模型细胞保护作用的考察

采用正交试验设计，将补阳还五汤7个单味药随机配伍分成补阳还五全方组、黄芪＋当归＋赤芍＋川芎＋红花组、黄芪＋当归＋桃仁＋地龙组、黄芪＋赤芍＋桃仁组、黄芪＋川芎＋地龙组、黄芪＋红花组、当归＋红花＋桃仁组、当归＋川芎组、当归＋赤芍＋地龙组、川芎＋红花＋桃仁＋地龙组、赤芍＋红花＋地龙组、赤芍＋川芎＋桃仁组。补阳还五汤原方考察浓度均为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.5 mg/mL，不同拆方中单味药浓度按照补阳还五汤原方中单味药比例进行确定。将细胞与药物共同作用2 h，再加入H2O2继续培育2 h。另设对照组（仅加细胞培养基）、正常组（无H2O2和药物处理）、模型组（仅加H2O2处理）。MTT法测定细胞存活率[（OD值处理组―OD值空白对照组）÷（OD值正常组―OD值空白对照组）×100％]。

2.3 体内动物模型制备、分组、给药及指标测定

采用大脑中动脉线栓法复制MCAO大鼠模型[3]。按体质量将大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组和精简方高、中、低剂量组，每组10只。术后第1日开始给药，补阳还五汤组给予补阳还五汤（相当于干浸膏3.15 g/kg），精简方各剂量组给予低（干浸膏1.68 g/kg）、中（干浸膏2.41 g/kg）、高剂量（干浸膏3.44 g/kg）灌胃[4]。模型组和假手术组给予等量无菌蒸馏水。给药体积均为0.05 mL/kg，每日1次。自由饮食、活动，连续给药7 d后脱颈处死取材备用。

2.3.1 脑梗死面积比检测 取大鼠脑组织-20 ℃冷冻20 min后去掉嗅球、小脑和脑干部分，取最大缺血断面，即漏斗柄部位及后叶尾极之间的脑组织。脑片37 ℃避光、2％红四氮唑染色30 min，正常组织呈深红色，梗死组织则为白色。断面拍照采用图像分析系统进行扫描，计算脑梗死面积。脑梗死面积（％）＝（健侧总面积－患侧非梗死区面积）÷2×健侧总面积×100％。

2.3.2 脑干湿重比检测 取大鼠脑组织，滤纸吸干其表面残留血渍，置于小称量瓶内称取湿重，再将称量瓶放入恒温干燥箱内，105 ℃恒温烤48～96 h至恒重（3次称样差别≤0.2 mg）。称干重后，计算脑组织含水量。脑组织含水量（％）＝（湿重－干重）÷湿重×100％。

3 统计学方法

4 结果

4.1 不同浓度补阳还五汤原方对氧化应激模型细胞保护作用的影响

图1 补阳还五汤对氧化应激模型细胞的影响（—x±s，n＝5）

4.2 补阳还五汤不同拆方对氧化应激模型细胞保护作用的影响

将10 mg补阳还五汤溶于10 mL PBS中，配制成1 mg/mL。按补阳还五汤原方配伍比例，确定10 mL拆方中黄芪为8.4 mg，当归为0.4 mg，赤芍为0.3 mg，川芎、红花、桃仁、地龙均为0.2 mg。MTT法观察不同配伍对PC12细胞的保护作用，结果发现补阳还五汤原方与黄芪＋川芎＋地龙的配伍对PC12细胞的保护作用最佳，见图2。将结果进行正交直观分析和方差分析，表明精简方最佳配伍组合为黄芪＋川芎＋地龙，见表1、表2。

图2 补阳还五汤不同拆方对氧化应激模型细胞的影响（±s，n＝5）

表1 补阳还五汤不同拆方对氧化应激模型细胞保护作用正交试验直观分析结果

表2 补阳还五汤不同拆方对氧化应激模型细胞保护作用的方差分析结果

4.3 精简方各单味药黄芪、川芎、地龙最佳配伍比例的确定

4.3.1 各单味药黄芪、川芎、地龙对模型细胞最佳保护作用浓度 根据补阳还五汤给药后的实验结果及预实验摸索，我们设定单味药黄芪考察浓度为0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL，川芎和地龙的考察浓度均为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL。

在较高浓度（0.5～4.0 mg/mL）范围内，黄芪浓度与模型细胞存活率呈正相关，对H2O2致损的PC12细胞发挥保护作用。由于2.0、4.0 mg/mL黄芪对模型细胞的保护作用差异无统计学意义，从节约资源和减轻对细胞毒副作用的角度，确定黄芪最佳给药剂量为2.0 mg/mL。川芎和地龙则相反，在0.1～0.5 mg/mL浓度范围内，细胞存活率明显高于模型组，而更高浓度没有保护作用，甚至产生毒副作用。见图3。因此，川芎和地龙的最佳剂量均为0.2 mg/mL。

图3 不同浓度单味药对氧化应激损伤模型细胞的影响（±s，n＝5）

4.3.2 黄芪、川芎、地龙不同配伍对模型细胞的保护作用 分别配制2.0 mg/mL黄芪、0.2 mg/mL川芎和0.2 mg/mL地龙，结合中医临床实践和正交试验结果，按黄芪∶川芎＝10∶3、黄芪∶地龙＝10∶1、川芎∶地龙＝3∶1比例进行给药，结果见图4。最佳作用浓度的黄芪、川芎、地龙不同配伍组均能对模型细胞发挥保护作用，精简方最佳配伍比例为黄芪∶川芎∶地龙＝10∶3∶1。

图4 最佳作用浓度黄芪、川芎和地龙不同配伍对模型细胞的影响（—x±s，n＝5）

4.3.3 精简方最佳作用浓度及其与PC12细胞的生物相容性 按黄芪∶川芎∶地龙＝10∶3∶1比例配制精简方，考察0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.5 mg/mL精简方和补阳还五汤对H2O2损伤PC12细胞的保护作用，见图5。在1 mg/mL范围内，精简方能有效防止H2O2过氧化作用（P＜0.05），当药物浓度＞1 mg/mL时，则对细胞产生明显的毒副作用。与补阳还五汤组比较，同一浓度的精简方能更好地发挥药效。

图5 精简方和补阳还五汤对体外氧化应激模型细胞的影响（±s，n＝5）

根据上述实验结果，设精简方和补阳还五汤与PC12细胞生物相容性研究的浓度均为1.0 mg/mL，与PC12细胞作用时间为1、2、4、6、16、24 h，见图6。精简方组在24 h内能促进细胞增殖，与PC12细胞的生物相容性好；从曲线变化趋势预测，甚至有可能在24 h后同样发挥药效作用，这有待于进一步研究。

图6 精简方及补阳还五汤与PCl2细胞的生物相容性（±s，n＝5）

4.4 精简方对模型大鼠脑梗死面积比的影响

按照预实验结果，精简方各剂量组分别给予低、中、高剂量灌胃，结果术后7 d，除假手术组外，模型组、补阳还五汤组和精简方高、中、低剂量组大脑左侧皮层部位均有梗死灶。模型组大鼠脑梗死面积比均值高达20.85％，精简方和补阳还五汤的药物干预均能显著减小脑梗死灶面积比（P＜0.05），精简方中、低剂量组优于高剂量组（P＜0.05），但与补阳还五汤组比较差异无统计学意义（P＞0.05），精简方中、低剂量组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。但从红四氮唑比值分布图提示精简方中剂量比低剂量样品的集中程度更好，疗效更优。因此，实验结果表明中剂量组疗效最佳。结果见表3、图7。

表3 各组大鼠脑梗死面积比比较（±s）

表3 各组大鼠脑梗死面积比比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05

组别 只数 剂量/（g/kg） 脑梗死面积比/％ 变异系数假手术组 5模型组 5 20.85±2.31 0.11补阳还五汤组 5 3.15 8.34±0.80*0.09精简方高剂量组 5 3.44 14.88±9.59 0.65精简方中剂量组 5 2.41 7.06±1.53*0.22精简方低剂量组 5 1.68 7.28±2.85*0.39

图7 各组大鼠脑梗死面积观察结果（红四氮唑染色，×40）

4.5 精简方对模型大鼠脑组织含水量的影响

脑缺血后，模型组脑含水量明显增加。治疗7 d后，精简方中、低剂量组和补阳还五汤组脑含水量显著减少，与模型相比较差异有统计学意义（P＜0.05）；精简方中、低剂量组之间及二者与补阳还五汤组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。提示精简方中、低剂量和补阳还五汤均能减低脑组织的水肿程度，且精简方中剂量效果最佳。结果见表4。

表4 各组大鼠脑组织含水量比较（±s）

表4 各组大鼠脑组织含水量比较（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05

组别 只数剂量/（g/kg） 脑组织含水量/％ 变异系数假手术组 5 78.43±0.71 0.04模型组 5 81.54±1.10 0.06补阳还五汤组 5 3.15 79.81±0.85*0.03精简方高剂量组5 3.44 81.66±2.91 0.08精简方中剂量组5 2.41 79.48±1.24*0.11精简方低剂量组5 1.68 80.25±1.51*0.16

5 讨论

补阳还五汤系清代医家王清任创立的治疗半身不遂辨证属气虚血瘀证的经典名方。本课题组前期大量研究表明，补阳还五汤能通过降低炎症反应、促进神经干细胞增殖、调控caveolin-1、Toll样受体等多种途径有效防治脑缺血损伤[5-12]。但因其药味众多，药效物质基础难以阐明，不能完全满足国际市场的标准，阻碍了其在国际市场上广泛流通。

补阳还五汤重用生黄芪，大补元气，使气旺则血行，瘀消而不伤正，为君药。配以当归尾活血和血，且有化瘀不伤血之妙，是为臣药。川芎、赤芍、桃仁、红花助当归尾活血祛瘀，地龙长于行散走窜、通经活络，均为佐药。各药合用，使气足以推动血行，瘀去络通，则筋肉得养，痿废可愈。本实验运用反向药理学方法，通过正交试验研究了补阳还五汤及其不同拆方对PC12细胞氧化应激模型的的保护作用，结果发现，补阳还五汤原方与黄芪＋川芎＋地龙的配伍对PC12细胞的保护作用最好，正交直观分析和方差分析亦显示最佳配伍组合为黄芪＋川芎＋地龙，为精简方的方药配伍提供了实验依据。

本研究考察了黄芪、川芎、地龙各单味药对H2O2诱导的PC12细胞氧化应激模型的保护作用，确定黄芪的最佳给药剂量为2.0 mg/mL，川芎和地龙最佳作用剂量为0.2 mg/mL，验证了中药配伍中“重用君药”的理论。黄芪、川芎、地龙两两配伍研究表明，最佳作用浓度的黄芪、川芎、地龙不同配伍组均能对模型细胞发挥保护作用；精简方最佳配伍比例为黄芪∶川芎∶地龙＝10∶3∶1。对PC12细胞的生物相容性的考察发现，精简方组在24 h内细胞存活率远高于100％，与PC12细胞的生物相容性非常好，为其临床用药的安全性提供了数据支持。

以MCAO模型大鼠为研究载体的体内实验表明，补阳还五汤和精简方中剂量改善模型大鼠大脑皮层梗死面积、降低脑组织水肿程度的作用最佳，且二者疗效相当，进一步验证了筛方结果。以上结果为进一步明确精简方的药效物质基础与其药物作用分子机制奠定了基础。

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Study on in Vitro Screening and in Vivo Validation of Optimized Buyang Huanwu Decoction

ZHANG Xiu-li1,2, MENG Pan1,2, XIANG Yun1,2, LEI Chang1,2, LIU Fang1, HUANG Dan1,2, CAI Chuan1,2, CAI Guang-xian1,2, WANG Yu-hong1,2
(1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China; 2. State Key Laboratory Training Bases of Powder and Innovative Drugs, Changsha 410007, China)

ObjectiveTo screen the optimized Buyang Huanwu Decoction (BYHWD); To verify it.MethodsH2O2was used to induce PC12 cell oxidative stress models. MTT method was used to determine the prevention effects of BYHWD at different concentrations (0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0, 3.5 mg/mL) on in vitro oxidative stress cell models to define the optimized concentration. Orthogonal design was used to divide BYHWD single medicine into decomposed BYHWD groups, control group (only with DMEM), normal group (without H2O2and medicine processing), and model group, to investigate the protective effects on PC12 cells. Optimized BYHWD was screened to decide the compatibility ratio of each medicine. MTT was used to detect the cell survival rate in each group. Middle cerebral artery occlusion was used to replicate MACO rat models. SD rats were randomly divided into sham-operation group, model group, BYHWD group and optimized BYHWD high-, medium- and low-dose groups. Each medication group was given relevant medicine for gavage. The screened results were verified.ResultsCompared with other decomposed BYHWD groups, the protective effects of the compatibility of Astragali Radix + Chuanxiong Rhizoma + Pheretima on PC12 cells was the best (P＜0.05), which was nearly equaled to BYHWD. Compared with the model group, BYHWD and the optimized one could evidently reduce cerebral cortex infarction area and improve the impaired brain edema (P＜0.05), and the medium-dose group was the best.ConclusionThe optimized BYHWD ratio is: Astragali Radix:Chuanxiong Rhizoma:Pheretima=10:3:1.

Buyang Huanwu Decoction; decomposed recipe; MCAO model; oxidative stress cell model; rats

R285.5

A

1005-5304(2017)02-0049-06

2016-04-12）

（

2016-05-12；编辑：华强）

国家自然科学基金青年基金（81403387）；湖南省教育厅一般项目（14C0862）；湖南省中医药科研计划项目（2014135）；中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地开放基金重点项目（2015年）；湖南中医药大学博士启动基金（自科）（9982-1001-015）

王宇红，E-mail：wyh107@126.com

DOl：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.014