杨 玲 方新元 贾立云 蔡扩军 徐 敏 蒲敬伟

（1.乌鲁木齐市高新区（新市区）六十户乡产业发展服务中心，新疆乌鲁木齐 830082；2.乌鲁木齐市米东区畜牧兽医站，新疆乌鲁木齐 831400；3.乌鲁木齐市天山区畜牧兽医站，新疆乌鲁木齐 830001；4.乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心，新疆乌鲁木齐 830063；5.新疆生产建设兵团第十二师畜牧兽医工作站，新疆乌鲁木齐 830009）

沙门氏菌的实验室检验技术

杨 玲1方新元2贾立云3蔡扩军4*徐 敏4蒲敬伟5

（1.乌鲁木齐市高新区（新市区）六十户乡产业发展服务中心，新疆乌鲁木齐 830082；2.乌鲁木齐市米东区畜牧兽医站，新疆乌鲁木齐 831400；3.乌鲁木齐市天山区畜牧兽医站，新疆乌鲁木齐 830001；4.乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心，新疆乌鲁木齐 830063；5.新疆生产建设兵团第十二师畜牧兽医工作站，新疆乌鲁木齐 830009）

本研究对80份沙门氏菌样品进行前增菌，然后用荧光PCR方法对前增菌样品进行检测，挑取阳性样品进行后续的分离、鉴定。结果显示，本研究在传统沙门氏菌分离、鉴定方法基础上增加了荧光PCR初步筛选，提高了检测的灵敏度与特异性，省工省时，最终分离到12株沙门氏菌。

沙门氏菌 荧光PCR 分离 鉴定

沙门氏菌是最常见的食源性人畜共患病原菌之一[1]。在自然界分布广泛，血清型种类繁多，该菌的最适生长温度为37℃左右，在20℃以上即可大量繁殖，在冰箱中可存活3～4个月[2]。消费者食用被沙门氏菌污染的食物12～72 h后即可出现腹泻、腹痛、恶心、呕吐、发热等发病症状[3]。近年来，沙门氏菌在全球范围内引起的食源性疾病数量不断上升，即便在欧美发达国家仍然难以控制。在欧洲，每年有超过16万人感染沙门氏菌，美国每年约发生感染沙门氏菌病例140万例。同时，沙门氏菌也是引起我国细菌性食物中毒的首要原因[4-6]。因此，开展对肉样和环境中沙门氏菌的检验具有重要公共卫生学意义。

在有较多样品量的情况下，完全采用国标传统检测程序方法对沙门氏菌进行分离、鉴定，耗时长、灵敏度低、试剂药品消耗多、工作量大，而荧光PCR方法虽然具有特异性好、灵敏度高、操作简单、安全、自动化程度高等很多优点，但只能检测到是否存在病原菌，最终分离不到沙门氏菌菌株[7-8]。鉴于此，本研究将二者结合起来，对沙门氏菌检测技术方法进行了优化改进，以期为沙门氏菌的检验及该病的防控提供有益参考。

1 材料

1.1 样品

畜禽粪便、畜禽肉、酮体拭子、环境拭子各20份，一共80份样品。

1.2 主要试剂

显色培养基购自法国科玛嘉公司；细菌分离鉴定的其他试剂购自北京陆桥公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒购自澳东检验检测科技有限公司；细菌鉴定卡购自美国bioMerieux Inc 公司。

1.3 标准菌株

鼠伤寒沙门氏菌标准菌株购于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。

1.4 主要仪器

法国梅里埃全自动微生物鉴定仪VITEK-2-CompactII；恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司。

2 方法

2.1 检验程序

2.2 操作步骤

2.2.1 前增菌

称取25 g（ml）样品放入盛有225ml BPW 的无菌均质杯中，以8000～10000 r/min 均质1～2 min，或置于盛有225ml BPW 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2 min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH 值，用1 mol/ml无菌NaOH或HCl 调pH至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500 ml锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36 ℃±1 ℃培养8～18h。如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15 min，或2℃～5 ℃不超过18 h 解冻[9]。

若为环境拭子样品。将盛有6mL BPW的离心管直接带到采样地点，采集环境拭子后快速打开盖子，将拭子放进后，迅速盖上盖子，带回实验室，于36 ℃±1 ℃培养8～18 h。

若为粪便样品。将盛有6 mLBPW离心管直接带到采样地点，采集粪便拭子后快速打开盖子，将拭子放进后，迅速盖上盖子，带回实验室，于36 ℃±1 ℃培养8～18 h。

2.2.2 PCR初筛

用细菌DNA基因组提取试剂盒，参照说明书提取细菌核酸。用沙门氏菌荧光PCR检测试剂盒，参照说明书进行荧光PCR检测。

2.2.3 增菌

取PCR阳性的前增菌液1mL接种于10mlTTB，于42 ℃±1 ℃培养18～24 h。

2.2.4 分离

接种环取TTB 1环，划线接种于一个XLD平板，一个显色培养基，观察各个平板上生长的菌落。

2.2.5 革兰氏染色镜检

对分离鉴定培养基上的可疑菌落进行纯化，革兰氏染色，镜检。

2.2.6 全自动微生物鉴定仪进行生化鉴定

根据革兰氏染色情况，选择对应细菌鉴定卡，用法国梅里埃全自动微生物鉴定仪VITEK-2-CompactII进行鉴定。

3 结果

3.1 荧光PCR扩增结果

经荧光PCR检测，一共出现了12份阳性，图1。

3.2 分离平板上菌落颜色及形态

典型的沙门氏菌在XLD 琼脂菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心（图2）。典型的沙门氏菌在显色培养基呈现紫红色。

3.3 革兰氏染色镜检

沙门氏菌呈革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌（0.7～1.5μm）×（2～5μm）（比大肠杆菌细），散在，无荚膜和芽孢，图3。

3.4 全自动微生物鉴定仪进行生化鉴定

经全自动微生物鉴定仪进行生化鉴定，一共分离出12株沙门氏菌。

4 讨论

传统食源性人畜共患细菌检测检验程序复杂烦琐，尤其在样品量较大的情况下，耗时费力，而荧光PCR法具有快速简便、敏感特异等优点，在临床疾病诊断、动物疾病检测、食品安全等领域的应用越来越广泛[10]。本研究用荧光PCR方法对样品进行初步筛选，选取阳性样品再进行下一步分离鉴定，提高了沙门氏菌的检出率和工作效率，为食源性细菌的快速检测提供了科学依据。但值得注意的是，由于荧光定量PCR只检测病原的核酸，并不能区分病原菌是否具有生物学活性。因此，如果样品中沙门氏菌物无生物学活性，PCR检测为仍阳性率，但并不能分离到沙门氏菌菌株。

[1] Newell D G，Koopmans M，Verhoef L，et al. Food-borne diseases-the challenges of 20 years ago still persist while new ones continue to emerge [J].International Journal of Food Microbiology，145（2-3）：493.

[2] 黄玉柳.食品中沙门氏菌污染状况及预防措施[J].广东农业科学，2010，46（6）：225 -226.

[3] 王军，郑增忍，王晶钰.动物源性食品中沙门氏菌的风险评估[J].中国动物检疫，2007，24（4）：23-25.

[4] Yang B W，Qu D，Zhang X L，et al. Prevalence and characterization of Salmonella serovars in retail meats of marketplace in Shaanxi，China [J]. International Journal of Food Microbiology，2010，141（12）：63-72．

[5] Li R C，Lai J，Wang Y，et al. Prevalence and characterization of Salmonella species isolated from pigs，ducks and chickens in Sichuan Province，China [J].International Journal of Food Microbiology，2013，163（1）：14-18．

[6] Rasschaert G，Houk K，Godard C，et al. Contamination of carcasses with Salmonella during poultry slaughter[J].J Food Prot，2008，71（1）：146-152.

[7] 封莉，黄继超，刘欣，等.食源性致病菌快速检测技术研究进展[J].食品科学，2012，33（21）：332-339.

[8] 杨娟，许美玲，张丽，等. 5种方法检测食品中沙门氏菌的结果比较[J].中国食物与营养，2013，19（9）：18-20.

[9] 中华人民共和国卫生部.GB 4789.4-2010.食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验[S].北京：中国标准出版社，2010.

[10] 任秀.食品中沙门氏菌快速检测方法的研究[D].吉林大学，2011.

新疆维吾尔自治区青年科技创新人才培养工程（qn2015jc058）；乌鲁木齐市科技局现代服务业促进计划项目（Y141310002）；兵团现代农业科技攻关与成果转化计划项目（2015AC026）；新疆生产建设兵团动物疾病防控重点实验室开放课题

杨玲（1974-），女，本科，兽医师，主要从事动物疫病防治工作。

蔡扩军（1985-），男，硕士，兽医师，主要从事食源性人畜共患病原菌及动物疫病防控工作。