毛爱民 杨芝芬 冯嘉林 陆宇超 金嘉旻 韩奇宏

(无锡市动物疫病预防控制中心，江苏无锡 214021)

生猪伪狂犬病的实验室诊断技术

毛爱民 杨芝芬 冯嘉林 陆宇超 金嘉旻 韩奇宏

(无锡市动物疫病预防控制中心，江苏无锡 214021)

猪伪狂犬病是危害全球养猪业的重大传染病之一，该病实验室主要诊断技术有病毒分离鉴定、聚合酶链式反应、家兔接种试验、中和试验、酶联免疫吸附试验、胶乳凝集试验等。本文重点介绍了病毒分离鉴定、家兔接种试验、ELISA试验三种方法，同时针对解剖技术、病理变化进行了相关技术分析。

伪狂犬病 gB抗体 gE抗体 病理

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PrV）引起的猪的急性传染病，也称奥耶斯基氏病（Aujeszky's disease），该病在猪呈爆发性流行，引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生的仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，临床上以发热、奇痒、脑脊髓炎和神经节炎为特征，是危害全球养猪业的重大传染病之一。

该病可根据临诊症状，结合流行病学，可做出初步诊断，确诊必须进行实验室检查。主要诊断技术有病毒分离鉴定、聚合酶链式反应、家兔接种试验、中和试验、酶联免疫吸附试验、胶乳凝集试验等，其中前三种适用于伪狂犬病毒检测，中和试验和酶联免疫吸附试验适用于狂犬病免疫抗体和非免疫抗体检测，最后一种适用于实验室和现场早期进行伪狂犬病抗体检测。目前，常用的实验室诊断方式为病毒分离鉴定、家兔接种试验、酶联免疫吸附实验。

1 病毒分离鉴定

病毒分离鉴定是诊断伪狂犬病的可靠方法。患病生猪的脑、心、肝、脾、肺、肾、扁桃体、鼻咽分泌物等均可用于病毒的分离的病料组织，但以脑组织和扁桃体最为理想。病料处理后可直接接种敏感细胞，如猪肾传代细胞（PK-15和IBRS-2）、仓鼠肾传代细胞（BHK-21），将病料按国标方法处理接种后进行培养，接种后36～72h内可出现典型的细胞变圆、拉网、脱落等病变效应。若初次接种无细胞病变，可盲传3代，如仍无细胞病变，则判为伪狂犬病毒检测阳性。

2 家兔接种试验

采取病猪脑组织、扁桃体、淋巴结等，混合剪碎、研磨，用生理盐水制成10%乳悬液，同时每1ml加青、链霉素各1000IU，离心取上清液接种于家兔皮下，每只2ml（用于接种的家兔必须事先用中和试验、胶乳凝集试验或ELISA试验等检测伪狂犬病病毒抗体阴性者才能使用），家兔经1～2d注射部位出现奇痒，家兔先用舌舔接种部位，以后用力撕咬接种部位，使接种部位被撕咬伤、鲜红、出血，持续4～6h，病兔衰竭，倒卧于一侧，痉挛，呼吸困难而死亡，为伪狂犬病毒感染阳性。如接种家兔仍健活，为阴性。

3 ELISA试验

因目前我国猪场使用的猪伪狂犬病疫苗基本都是gE基因缺失苗，因此可以用ELISA抗体检测技术进行野毒感染鉴别和免疫抗体水平监测，其中伪狂犬病gE抗体检测盒检测猪血清中是否存在gE野毒抗体，鉴别有无感染伪狂犬病野毒，伪狂犬病gB抗体检测盒主要检测伪狂犬免疫抗体水平，但分析前提是群体gE阳性很低或均为阴性（如果gE抗体阳性，则gB抗体有部分来自野毒感染后产生的抗体），只有很高的伪狂犬抗体才可以抵抗伪狂犬病毒的感染（gB阳性率＞90%、离散度＜40），同时高抗体可以降低伪狂犬排毒。该方法是猪场特别是种猪场进行伪狂犬病净化的主要检测技术，具体操作方法见检测盒说明书。对于两种检测盒可出现3种情况，分别为：gB-、gE-，没有免疫，没有感染；gB+、gE-，免疫合格，没有感染；gB+、gE+，感染（免疫或未免疫）。而gB-、gE+，是不可能出现的。

4 病死猪解剖技术

伪狂犬病死猪如要做病毒分离、家兔接种、病理分析等实验，必须要掌握病死猪解剖技术。要按下列步骤依次进行：进行外部检查、固定剖腹检查脏器、腹腔器官的采出与检查、胸腔剖开与各器官的检查、颅腔剖开、口腔和颈部器官采出。在做解剖工作的同时一定要注意以下事项：一是在猪死亡以后，尸体剖检进行越快、准确诊断的机会越多。夏季须在死后4～8h之内完成，冬季不得超过18～24h。二是剖检中要做记录和拍照，将每项检查的各种异常现象详细记录下来，同时将肉眼病变组织拍照，以便做出初步诊断。三是剖检过程中要注意个人防护，穿好防护服、带好口罩、手套，防止感染。四是尸体剖检后要进行无害化处理，如深埋、焚烧等。剖检完后所用的器具、台面、地面等都要进行严格的消毒处理。

5 病理变化

我国2011年后产生猪伪狂犬病毒株经国内各科研院所的专家团队深入研究，推测为变异毒株，因此为了更好地进行生猪伪狂犬病诊断分析，动物疫病预防控制中心在以猪主要病原均为阴性的仔猪为基础上建立的猪伪狂犬病毒变异株单因子发病模型实验，从实验来看病理肉眼变化明显的器官主要有：脑组织水肿；肾脏红色针尖状出血点，有的肿大，有黄疸；扁桃体出血，有两头有溃疡；肝脏：出现白色针尖状坏死点；肺脏：出血，水肿；淋巴结肿大出血。取病变组织，常规石蜡切片，HE染色，镜检主要组织病理变化。病死猪主要变化为：肝脏的门静脉、汇管区以及窦状隙瘀血，并伴有肝小叶的大量出血，干细胞变性坏死；肺脏的肺泡内大量出血，肺间质增宽；脑内呈现噬神经元现象等非化脓性脑炎典型病变；脾脏：淋巴细胞缺失，有坏死灶。

[1]宣长和，马春全.猪病学（第三版）[M].中国农业大学出版社，2010.

江苏省农业三新工程项目“生猪伪狂犬病综合防控技术的推广应用”，合同编号：SXGC[2015]024。