雷宇平 王仲兵 张仲萍 罗甜甜

（山西省动物疫病预防控制中心，山西太原 030000）

山西省猪链球菌的分离鉴定及耐药性研究

雷宇平 王仲兵 张仲萍 罗甜甜

（山西省动物疫病预防控制中心，山西太原 030000）

猪链球菌（streptococcus suis）作为一种人畜共患的病原可引发多种疾病，极大的危害了人和动物的健康。这种病原体生存范围广，繁殖快，对人畜都带来严重的损失。传统的链球菌分离检测方法耗时耗力，随着生物科学的发展，PCR检测取得了瞩目的成绩，不仅能够使我们直观的了解其毒力特性，还能为临床治疗以及疫病预防提供科学的依据。本文对山西省猪链球菌做了分离鉴定并对耐药性进行系统的研究。

猪链球菌 分离 鉴定 耐药性

猪链球菌不仅能在猪群中引发败血症、脑膜炎、支气管炎等疾病，还会导致孕猪流产、胎猪畸型等，使养猪业承受巨大经济损失。猪链球菌共有血清1-34型和1/2型共35种。其中，血清2型的毒性最强，也是我国最主要和最流行的致病型血清。在20世纪末，我国江苏省就暴发了猪链球菌引起的流行性SS2，导致大量猪和工作人员感染死亡，2006年夏天，我国四川省再度暴发SS2，不仅经济损失惨重，也威胁到了人类公共卫生安全。虽然抗生素的治疗猪链球菌的良好办法，但由于不专业的操作和科学意识的薄弱使得抗生素滥用情况普遍，动物体内的耐药菌近年来大幅增加。本研究从山西省11个市15个猪场采集病死猪（疑似猪链球菌感染的发病猪）的扁桃体、脾脏以及肾脏等脏器，通过观察菌落形态以及PCR来对其进行鉴定。当确定其为猪链球菌后，对其进行药物敏感测试，分析山西地区猪链球菌的耐药性，以便为临床用药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料

病料来自山西省11个市15个猪场中临床症状疑似2型猪链球菌感染发病猪的脏器和全血，并经过分离得到2型猪链球菌，标准参考菌株为HA9801，由山西医科大学动物医学院兽医系王志梅老师提供。

1.2 仪器

研究所需的PCR扩增试剂、PMD18-T载体和DNA maker购自北京博凌科为生物科技有限公司，THB培养基购自TaKaRa公司，医用净化工作台购自天津实验仪器设备厂，凝胶图像处理系统产自上海天能生物技术有限公司。

1.3 方法

首先，猪链球菌病的分离鉴定要先进行分离培养纯化。采用无菌手段采集被2型猪链球菌感染的猪的全血和脏器，将其在琼脂平皿上进行划线分离，盖上盖子将其倒置于37℃的保温箱中约20h，在此期间，要对菌落的形态和变化趋势进行观察，看其是否形成灰白色半透明状的凸起菌落。然后，对照染色镜检，看是否形成圆形成对的短链排列阳性球菌，若血平板显示为α溶血，则表示鉴定为2型猪链球菌落。将其移至THB液体培养基中，对其进行24h37℃增菌培养，完成后再次进行染色镜检，对培养液体无杂菌者选出进行保存。

其次，进行PCR 的鉴定。SS2的检测需要16SrRNA保守区、GDH、CPS等基因设计来共同完成。作为当前世界上公认的强毒力因子，CPS基因设计引物根据其独有的方法，能够准确鉴定1、 2、9、14和1/2型菌株。由于GDH是一种免疫原型蛋白，其保守型和突变率都很低，也是其成为SS2鉴定依据的重要原因。具体操作方法如下：在培养液中提取基因组为模板，将其配置到PCR反应液中，即PCR M IX 12.5 μl。加入游引物1μl，模板2μl，ddH2O至25μl。用净含量为1%的琼脂糖凝胶进行电泳，并将PCR试剂回收至胶盒中。

耐药性的测定采用了5种临床上应用于猪链球菌常见的抗菌药，如庆大霉素、氯霉素、丙环沙星、阿莫西林和磺胺甲唑。将2型猪链球菌的分离株在心脑培养液中进行接种，将温度设定为37℃，菌液浊度为1×10nCFU/ml，并用生理盐水进行稀释，比例为1：800。

2 结果与分析

2.1 镜检结果

在该试验中，分离的菌株与2型猪链球菌分离培养结果一致，都是光滑的灰白色隆起透明的小菌落，经观察，在培养液中，静止12h后，培养基下方开始变浑浊，底部有黏稠菌体沉淀，形状不规则。对其进行染色镜检后，确定其为2型猪链球菌菌体。

2.2 PCR鉴定结果

为进一步确定实验的真实性和科学性，采用了GDH毒力因子对其进一步筛选。将一部分2型猪链球菌进行扩增回收测序，发现其与其他GDH基因序列的同源性达98%，与NCBI的CPS2J基因序列同源性达99%。

2.3 耐药性鉴定结果

测试结果表明，山西该地 猪链球菌对5种药物的耐药性分别为71%、82%、55%、53%、69%。其中，对氯霉素的耐药性最高，其次为青霉素类药物。

3 结语

通过本次研究发现山西地区疑似猪链球菌感染主要是2型猪链球菌菌体。在现代化养猪场中，猪链球菌已成为最主要的传染病源之一，其疫苗免疫也成为常规免疫程序，但疫苗的应用效果有待提高。同时，猪链球菌的耐药性不断增加，给治疗带来了一定难度。临床工作者在治疗过程中不得盲目用药，最好先进行敏感测试，再进行抗感治疗。

[1]王红宝，李红丽，郭雪丽.山西省致病性猪链球菌毒力基因测定及耐药性监测[J].养猪，2015，（6）：113-115.

[2]黄碧莲.猪链球菌病病原分离鉴定及防治试验[J].兽医导刊，2016，（14）：206.

∶山西省重点研发计划项目

项目名称∶猪链球菌病综合防控技术研究

项目编号∶201603D221023-3