牛继伟，孙晓军，孟晓琴，汪占弟，马莉萍

(兰州市动物疫病预防控制中心，甘肃 兰州 730050)

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Masson-Fontana银染色法改良研究

牛继伟，孙晓军，孟晓琴，汪占弟，马莉萍

(兰州市动物疫病预防控制中心，甘肃 兰州 730050)

为简化常规Masson-Fontana染色法显示嗜银细胞的染色流程、缩短染色时间，并获得良好染色效果，通过研究对改变影响染色效果最为关键的氨银溶液浓度、浸染温度和时间等因素对该方法进行了改进，经过反复实验，探索出在60℃水浴中用2.5%氨银溶液浸染石蜡切片1 h能得到较好的染色效果，嗜银细胞着色深浅适宜，背景较浅，嗜银颗粒清晰可辨，细胞核明显。说明改良后的Masson-Fontana银染法更为便捷，可以用于嗜银细胞的染色。

嗜银细胞；Masson-Fontana；银染色法

胃肠道黏膜中散在着多种内分泌细胞，它们具有共同的细胞化学特点，都具有产生胺类和肽类激素的功能[1-3]。由于这些细胞产生的胺类和肽类激素都贮存在胞浆中的分泌颗粒中，可以采用组织化学染色中的亲银和嗜银染色来显示，因此这些细胞通常都被称为嗜银细胞[4]。目前主要采用免疫组化或特殊的银染方法来显示这些细胞。然而，从经济角度、操作的简易程度及染色的综合效果来看，特殊的银染方法仍不失为一种经济、简便而又实用的显示方法，受到了广大科研工作者的普遍认可。在众多的银染色法中，Masson-Fontana银染色法以其结果相对稳定、非特异性着色少等特点而被广泛使用[5-7]。然而，常规 Masson-Fontana染色法显示嗜银细胞时需要在氨银溶液中浸染12～18 h或更长时间[8-9]，这样不仅耗时，而且也会增加掉片的几率。

1 材料与方法

1.1 切片标本的制备

健康双峰驼皱胃贲门腺区新鲜组织，经10%中性福尔马林溶液固定，按照常规方法制作石蜡切片。

1.2 氨银溶液的配制

取10%硝酸银水溶液20 mL，逐滴加入浓氨水，边加边摇晃，直到产生的沉淀逐渐溶解为止，再滴加10%硝酸银水溶液数滴至溶液呈轻度混浊为度。此溶液可短期保存，但最好临用前现配制。使用前稀释成合适浓度过滤后使用。为摸索出氨银溶液的最佳工作浓度，本实验中将此溶液分别用蒸馏水稀释成5%、2.5%、1.25%、0.6%、0.3%5个浓度进行对比实验。

1.3 方法

石蜡切片常规脱蜡至蒸馏水洗，分别进行如下实验。将第一批切片入以上不同浓度氨银溶液，置于室温下避光浸染18 h，蒸馏水洗，加0.2%氯化金水溶液调色2～3 s，蒸馏水洗，再入5%硫代硫酸钠水溶液固定5 min，用蒸馏水洗，Van Gieson氏染液复染1～2 min，95%乙醇急速分化数秒，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，光镜下观察；第二批切片入预热至40℃或60℃的不同浓度氨银溶液中，分别进行30 min，1～2 h避光浸银反应，试图找到最佳浸银反应浓度、温度和时间，其他步骤同第一批。

2 结果

2.1 氨银溶液的浓度对浸银染色的影响

不论是用常规Masson-Fontana染色法，还是用经过改良的染色法，2.5%的氨银溶液染色效果较好，背景较浅，细胞着色深浅适宜，嗜银颗粒清晰可辨，细胞核也明显可见。高倍镜下可见胃贲门腺腺体中的嗜银细胞主要位于腺体基部的腺体细胞之间，胞浆中有大量的分泌颗粒被还原的银盐染成棕黑色，细胞大多单个夹于其他上皮细胞之间，呈不规则的锥体形、圆形或梭形，胞核圆形，位于细胞中央或一侧（见图1）。

图1 2.5%氨银溶液60℃避光作用1 h后胃贲门腺内的嗜银细胞(改良Masson-Fontana银染色法，×400)

2.2 氨银溶液温度和浸染时间对染色效果的影响

研究发现，用预热的氨银溶液60℃避光作用1 h后，浸银染色效果最佳。随着温度的升高和时间的延长，嗜银细胞和背景组织着色太深，嗜银颗粒相互融合，使得整个嗜银细胞呈均质的黑色，细胞核也不清楚（见图2）。

3 讨论

研究证实，在相同温度和时间下，2.5%的氨银溶液浓度染色效果较好，氨银溶液浓度高于该浓度或是低于该浓度染色效果都不及该浓度染色效果好。氨银溶液浓度高使得背景组织和嗜银细胞着色太深，不易于观察结果。氨银溶液浓度低使得部分嗜银细胞不能充分与氨银溶液作用，导致着色率下降。2.5%的氨银溶液染色效果较好，背景较浅，细胞着色深浅适宜，嗜银颗粒清晰可见，细胞核也明显可见。

图2 2.5%氨银溶液室温下浸染18 h后胃贲门腺内的嗜银细胞(Masson-Fontana银染色法，×400)

本研究中，用Van Gieson氏染液复染切片1～2 min，组织背景呈淡红色，与黑色的嗜银细胞形成明显的对比和反差，与不复染的切片相比效果更佳，更易于观察。

综上所述，改良后的Masson-Fontana银染法较传统方法更省时省力，能够得到满意的染色效果，可以被广泛用于科学研究和临床检测中。

[1] Pearse A G.The diffuse neuroendocrine system and the APUD concept:related“endocrine”peptides in brain，intestine, pituitary,placenta，and anuran cutaneous glands[J].Med Bio，1977,(3).

[2] 胥维勇,杨群,范小莉.显示神经内分泌细胞的染色方法[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2006,（1）.

[3] 王新亭.神经内分泌细胞浸银染色方法的探讨与应用[J].徐州医学院学报,2000,(2).

[4] 邹仲之.组织学与胚胎学[M].人民卫生出版社,1978.

[5] 张苏,朱旻,陈永珍.嗜银细胞染色方法的探讨[J].交通医学,2007,21（2）.

[6] 赵荧.普通银染技术与微波银染技术的比较[J].解剖学杂志,1985,（1）.

[7] 曾孝儒,刘金宝,刘浩.豚鼠小肠EC细胞的免疫细胞化学和银染法的比较研究[J].天津医科大学学报,1997,（3）.

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[本文获甘肃省首届兽医系统征文比赛三等奖]

（编辑：赵鹏飞）

R361.2

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1006-799X(2016)21-0015-02

牛继伟（1981-），男，甘肃陇西人，兽医师，主要从事动物疫病防控研究。