任军方　杨珺　王丹萍等

摘要：采用根段共培养法，利用不同分离培养基（孟加拉红培养基、PDA培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基），通过控制不同培养条件和消毒条件，从卷萼兜兰菌根中分离内生真菌，再用点植法进一步分离，得到纯化菌株。对得到的真菌进行形态和显微结构观察，用于鉴定真菌的分类。结果表明：根段共培养法分离时的表面消毒条件、培养条件和分离培养基的选用均直接影响菌根真菌的分离效果及其多样性。本研究旨在对卷萼兜兰菌根的研究方法进行初步试验，为其更深入的研究提供科学参考。关键字：卷萼兜兰；茵根；内生真菌；分离

海南卷萼兜兰是海南特有的一种兰花，其株型优美、花朵艳丽、花期较长、具有极高的观赏价值。目前，卷萼兜兰的利用整体上仍处于直接从自然界获取的低级阶段，近年来，过度的采挖和环境的恶化使野生资源受到了严重破坏。常规的分株繁殖速度慢、且易伤母株，而卷萼兜兰组培困难，无菌苗移栽成活率很低，生长缓慢，不易开花，其原因是兰根中没有形成菌根结构，不能为兰花的生长提供所需的营养物质。组培苗菌根化是促进卷萼兜兰快速繁殖的重要技术，也是解决濒危兰花资源人工栽培的关键。因此，研究兰花与其菌根真菌的共培养体系和菌根结构，可为探讨菌根真菌与兰科植物之间的相互作用，以及人工接种大量繁育提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

人工栽培于温室大棚的卷萼兜兰植株，基质为泥炭土，株龄1年以上。

1.2试验方法

1.2.1菌根真菌的分离及培养。分离方法主要参照郭顺星等的关于菌根菌的分离方法，并略作改进。自根尖取兰科植物新鲜营养根，清水冲洗一洗洁精泡洗2min-清水洗净→无菌水冲洗3遍→75%酒精消毒20s→无菌水冲洗1遍→2%次氯酸钠消毒处理（min）→无菌水冲洗3～5遍→无菌滤纸吸干，用灭菌工具在培养皿中将根切成0.5～1cm的根段，根段分别置于孟加拉红培养基、PDA培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基上，每个培养皿3个根段，于28%、40%光照的恒温光照培养箱培养，培养条件设置光照培养与遮光培养（称为光培养和暗培养）对比；根段表面与横切面长出菌落后，挑取菌落边缘菌丝转移至另一平板的中心进行纯化培养，观察记录，直至菌落长满平板，置于4℃冰箱保存备用。

1.2.2不同浓度的次氯酸钠溶液的消毒试验。配制不同浓度的次氯酸钠溶液：0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%9个浓度。配好后，棕色瓶于阴暗处保存。接种：采用PDA培养基，材料处理方法同上，分别用不同浓度的次氯酸钠消毒4min，每个浓度梯度处理的材料接种4皿，光培养和暗培养各2皿。

2结果与分析

2.1真菌分离方法的试验效果

2.1.1孟加拉红培养基培养菌根真菌的结果。根据表1，可以发现2%次氯酸钠消毒液处理3、4、5min均可分离出真菌，随着消毒时间的增加，其杂菌污染率有降低趋势但也导致真菌丰富度的降低；不同培养方式可以分离出不同的真菌，暗培养的分离效果较光培养好些。该培养基初步分离纯化出了5种较典型的真菌，对其菌落特征进行观察描述（图1、表2），为后期鉴定分类工作做好准备。

2.1.2沙氏葡萄糖琼脂培养基培养菌根真菌的结果。从表3可以看出，根段在相同浓度消毒液处理条件下处理3、4min与光、暗培养不同方法均可培养出真菌，消毒处理4min污染率较稳定，暗培养分离出的菌根菌数量比光培养丰富。该培养基分离纯化得到3种典型真菌，并做形态学观察描述（图2、表3）。

2.1.3 PDA培养基培养菌根真菌的结果。采用相同浓度的消毒液处理根段，不同处理时间下，进行光培养或暗培养都能分离出真菌（表5）。在相同处理时间下，暗培养的污染率均比光培养的污染率小，暗培养分离出的菌根菌数也较光培养的多，总体上暗培养效果比光培养好。该培养基亦纯化得到3种较为典型的真菌（图3，表6）。

2.2不同消毒液浓度对真菌分离的影响

用不同浓度的消毒液处理根段，材料消毒时间均为4min（表7），都分离出了真菌。对比可知，不同的次氯酸钠浓度对真菌的分离效果不同，消毒液浓度增高，则培养过程中杂菌污染有降低趋势，菌根菌落数也相应有所减少，浓度为1.5%～3.0%的消毒液处理培养的效果较佳。

3结论与讨论

本试验对不同消毒时间和不同培养方式的分离结果进行比较，以及3种不同培养基的对比，得出如下结论：

（1）以75%酒精处理30s+2%次氯酸钠溶液处理4min进行表面消毒，为较适宜的处理方法。用此方法处理材料分离培养真菌的效果相对稳定，消毒液浓度过低或消毒处理时间过短均会造成杂菌污染严重，浓度过高或处理时间过长可能会使菌根菌大量致死，达不到分离目的。

（2）以孟加拉红培养基，为较适宜的培养基。试验采用的3种培养基均为真菌的选择性培养基，适合于真菌生长，但各有优缺点。通过试验发现，孟加拉红培养基分离菌根具有一定优势，其因成分中包含玫瑰红钠而得名，该物质有抑制菌落疯长的作用，避免菌物混为一体，便于观察、计数、统计。培养基为半合成固体培养基，成分具有一定比例的氯霉素，避免自主配制时抗生素失效而影响效果。因此，孟加拉红培养基用于分离卷萼兜兰菌根真菌较为适宜。