石茭 韩琳 李晶兢 静媛媛 郑宏伟 余力生

北京大学人民医院耳鼻喉科(北京100044)

·基础研究·

耳后给药及鼓室给药外淋巴液药物浓度的实验观察

石茭 韩琳 李晶兢 静媛媛 郑宏伟 余力生

北京大学人民医院耳鼻喉科(北京100044)

目的 研究耳后皮下注射给药、鼓室内给药后外淋巴液中地塞米松磷酸钠的药物代谢动力学特征，探讨两种给药途径的药代动力学差异。方法 以地塞米松磷酸钠(10mg/ml)为药物示踪剂，将豚鼠随机分为耳后注射（耳后组）和鼓室内给药（鼓室组）2组，耳后组给药量为1ml（10mg/ml），鼓室组给药量为0.1ml（10mg/ml），分别采集耳后组给药0.25、0.5、1、2.5、5、6、8小时外淋巴液及鼓室组给药后0.5、1、2、3、4、6、8小时外淋巴液，用高效液相色谱法分别检测其中的药物浓度。结果①两种方式给药后，豚鼠外淋巴液中均可检测出地塞米松，且浓度均随时间的延长呈下降趋势；②鼓室组：给药后0.5～8h外淋巴液中均可检出有效药物成份地塞米松，3h达峰，其峰浓度（Cmax）最高为906.55mg/l，生物半衰期为1.27h。③耳后组:给药后0.25～8h可检出地塞米松，其达峰时间（Tmax）为0.25h，其峰浓度（Cmax）最高为18.83mg/l，生物半衰期为3.36h。④鼓室组给药量为0.1ml，耳后组给药量为1ml，外淋巴液中鼓室组地塞米松的浓度高于耳后组。⑤耳后组药物半衰期比鼓室给药组高。结论 提示耳后皮下注射给药药物可能通过多种途径进入外淋巴，药物浓度相对鼓室给药低；鼓室给药组因避开血脑屏障及血迷路屏障故可较快进入外淋巴，保持较高药物浓度；结合临床我们可推测激素在外淋巴中可能低浓度即可起效。

地塞米松磷酸钠；地塞米松；耳后皮下注射；鼓室给药；药代动力学

①Beijing university clinical research projects.Subject name：A multi-center,open,randomized,controlled clinical trial about the postaurieal injection of glucocorticoid to treat the sudden deafness.NO：PUCRP201307②National Science foundation of China;Subject name: The research about mechanism of postaurieal injection,which is a new way of drug delivery to treat inner ear diseases.NO:81070780

Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest

近年来，突发性聋、梅尼埃病、自身免疫性内耳病、Cogan综合征、遗传性非综合征性聋、噪声性聋等内耳疾病在世界范围内发病率上升，且呈现年轻化趋势[1，2]。糖皮质激素目前已广泛应用于临床多种内耳疾病的治疗，国内外均有报道疗效较好[3，4]。全身给药，由于血迷路屏障的存在,需要长期大剂量应用糖皮质激素，可能出现较严重的副作用，限制了临床运用[5]。由于血-内耳屏障及耳蜗外淋巴-脑脊液屏障的存在，限制了药物从血到内耳的转运[6],局部给药越来越受到重视[7，8]。

目前较为常用的局部给药方式为鼓室给药[9]，此法的效果及相关研究国内外均有报道。经鼓室给药，为有创治疗，可引起疼痛、眩晕、味觉障碍、鼓膜穿孔、中耳感染等并发症[10]；药物可经咽鼓管流失，药物进入内耳的剂量难以控制、持续给药效果不稳定等[11]。另一种由国内学者余力生发现的耳后注射给药，之前的相关临床及实验数据都证实了其安全性及有效性。耳后注射给药，作为一种微创且有效的局部给药方式，国内外目前少见报道。

目前，尚无实验比较耳后皮下给药及鼓室给药两种方法药物在内耳的代谢差异，基于此点，本研究通过比较耳后皮下注射和鼓室给药，以地塞米松磷酸钠为药物示踪剂，应用高效液相色谱技术，了解两种局部给药方法药物在内耳中的药代动力学特征，为局部给药治疗内耳疾病的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择健康、电耳镜检查外耳道及鼓膜无异常，preyer反射正常的白色红目豚鼠70只，体重250～350g，健康，SPF级，雌雄不限。按照给药途径不同随机分为2组：耳后皮下注射给药组(35只)、鼓室给药组（35只）；水合氯醛（10%，3mg/kg，国药集团化学试剂有限公司）进行腹腔注射，麻醉满意后，将动物四肢固定于实验台上，维持体温于37℃。

1.2 给药方法

使用地塞米松磷酸钠1ml（中国药品生物制品检定所[100016-201015]，以注射用灭菌蒸馏水配成浓度为10mg/ml的溶液）作为实验药物。耳后组:选择右侧耳后皮肤无毛处用1ml注射器进行皮下注射地塞米松磷酸钠1ml。鼓室组:右耳朝上，在手术显微镜下，先用无菌注射针头在右侧鼓膜前下方刺一小孔，再用100μl微量注射器在鼓膜八点位置注射100μl实验药物进入鼓室，可在显微镜下观察到鼓室液平面不断上升，直至漫溢。注射后让其继续侧卧30min，抬高鼻侧，保持鼻侧高于枕侧位，注意保温，清醒后放入饲养笼，正常进食。

1.3 取材方法

分别采集耳后皮下注射给药0.25、0.5、1、2.5、5、6、8小时（h）及鼓室给药后0.5、1、2、3、4、6、8小时（h）右侧外淋巴液，每个时间点一次性取样，每个时间点分别采取5份样本。(所有样品取材后立即存放于-20℃冰箱内)。外淋巴液采集方法：到达预定时间时，用10%水合氯醛麻醉后，断头，取出颞骨，剔除肌肉组织及听泡外骨质，取出听泡，予生理盐水充分冲洗圆窗龛及听泡三遍以去除标本中的残留血液，用滤纸吸干圆窗处的冲洗液，防止样品被“污染”。细针尖刺破圆窗膜，用微量进样器从耳蜗鼓阶中缓慢抽取外淋巴液约10μl。所有样品取材后立即存放于-20℃冰箱保存。

1.4 高效液相色谱分析

仪器:DIONEX ULTIMATE高效液相色谱仪（包括两个ULTIMATE 3000三元梯度泵、ULTIMATE 3000 RS柱温箱、ULTIMATE 3000自动进样器、UL⁃TIMATE 3000 DAD和六通阀）；旋涡混合器，MX-S可调式混匀仪（大龙医疗设备有限公司）；离心机，Sigma3K-18；SHBⅢ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；Genex Beta Pipette移液枪100～1000μl；Genex Beta Pipette移液枪20～200 μl；Genex Beta Pipette移液枪2～20μl。

试剂：乙腈（色谱纯，天津赛弗），纯净水（娃哈哈饮用纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司出品），甲酸（Sigma，94318-50mL-F），甲酸铵（分析纯，天津市光复精细化工研究所）。对照品：地塞米松（购于中国食品药品检定研究院）；内标氢化可的松（购于百灵威试剂公司）。方法学验证专属性：因地塞米松磷酸钠给药后，在淋巴液中以地塞米松的形式存在，因此本实验采用地塞米松作为标准品进行方法学验证。结果表明流动相不干扰地塞米松和内标氢化可的松的测定，淋巴液中两种被测成分均与内源性物质分离良好，分离度均＞1.5。地塞米松和内标的保留时间分别为：5.73 min和3.68 min，重复性较好；地塞米松和内标的塔板数分别为：1346和1546。标准曲线：按照制备标准曲线样品，每个浓度平行测定5次，记录地塞米松及内标的峰面积，以地塞米松与内标峰面积比的平均值Y，对甲波尼龙琥珀酸钠的淋巴液浓度X做回归计算，在浓度范围：1 mg/mL～50 μg/mL得到线性回归方程为：Y=0.0053X-0.0873（R2=0.9993，n=5，图2）；在浓度范围：250 μg/mL～10 μg/mL得到线性回归方程为：Y=0.0048X-0.0061（R2=0.9991，n=5，图2）。各浓度的峰面积比值的RSD%在1.73%-7.46%间，满足指导原则的要求（≤15%）。检测限和定量限：地塞米松的检测限为5 μg/mL，RSD%为5.34%；定量限为10 μg/mL，RSD%为7.43%。日内和日间精密度：考察地塞米松在低、中、高三种浓度淋巴液样品中的日内和日间精密度。低、中、高三种浓度对应的日内和日间RSD%值分别为：6.83%、4.23%、6.94%；8.12%、6.06%、6.24%。回收率：将回收率样品经过标准曲线计算得到的地塞米松的浓度为X1；回收率样品的实际浓度为X2，以X1与X2的比值作为地塞米松的回收率，得到高、中、低三种浓度的淋巴液样品中地塞米松的回收率分别为94.88%、118.36%、118.69%（RSD%=2.47%、4.36%、7.47%，n=5）。

1.5 统计学方法

采用Excel10.0软件(Microsoft公司，美国)计算均数、标准差，均数结果用±s表示。SPSS17.0软件(SPSS公司，美国)行t-检验。采用DAS 2.0版程序计算药代动力学参数。

2 结果

耳后组给药后0.25、0.5、1、2.5、5、6、8h及鼓室组给药后0.5、1、2、3、4、6、8h外淋巴液中均可检出地塞米松磷酸钠的代谢产物地塞米松，其浓度见表1，参数比较见表2，其药代动力学曲线见图1、图2、图3。

表1 地塞米松浓度（±s）（μg/ml）（n=5）Table 1 concentration of dexamethason（±s）（μg/ml）（n=5）

表1 地塞米松浓度（±s）（μg/ml）（n=5）Table 1 concentration of dexamethason（±s）（μg/ml）（n=5）

time（h）0.25 0.5 1 2.5 time（h）0.5 5 6 8 postaurieal injection 18.83±16.44 10.70±7.40 8.50±1.74 8.50±1.74 14.73±4.76 12.04±2.38 7.94±2.52 1 2 3 4 6 8 intratympanic injection 124.85±65.38 201.99±128.59 485.27±118.44 906.55±219.32 519.07±198.55 175.08±69.56 207.59±102.29

表2 地塞米松药代动力学对比Table 2 pharmacokinetics of dexamethasone of two groups

图1 两种给药途径后地塞米松药代动力学曲线Fig.1 pharmacokinetics curve of dexamethasone of two groups

图2 耳后给药后地塞米松药时曲线Fig.2 pharmacokinetics curve of dexamethasone in the postaurieal group

图3 鼓室给药后地塞米松药时曲线Fig.3 pharmacokinetics curve of dexamethasone in the intratympanic group

由图1可见，①与鼓室组相比，耳后组在外淋巴液中的浓度相对低，但耳后组出现高峰时间早，给药后0.25h后浓度为高峰（18.83±16.44），此后浓度逐渐下降，由于此法检测下限为5μg/ml，12h未检测出地塞米松；②与耳后组相比，鼓室组药物在外淋巴液中的浓度高，出现峰值时间为3h。由表2可见，耳后组的Tmax比鼓室组小，较快达到峰值；T1/2、MRT均比鼓室组更长。由于药物在外淋巴液存留的时间与其在外淋巴液的效力大小相关，因此，耳后给药方式可能更能延长药物在外淋巴液的存留时间，促使药物在内耳发挥作用。

3 讨论

内耳疾病治疗有效与否，取决于所用药物及该药物能否在病变局部达到治疗所需浓度，但何种途径给药以及多大剂量才能使药物在内、外淋巴液中达到有效浓度一直是学者们的研究内容。

目前较为常用的局部给药方式为鼓室给药[9]，此法的效果及相关研究国内外均有报道。另一种由国内学者余力生发现的耳后注射给药，之前的相关临床及实验数据证实了其安全性和有效性。临床实践证明，耳后注射皮质类固醇可有效治疗顽固性低频型感音神经性聋[12]。动物实验研究表明，相同给药剂量下，耳后给药比全身肌注给药更能在内耳中达到相对高的血药浓度，且维持时间较长，总量较大；耳后给药后药物在体循环血中相对全身给药保持较低浓度水平，从而降低了糖皮质激素引起的全身副作用[5,13,14]。

地塞米松在内耳疾病治疗中被广泛应用，虽然还没有研究报道，内耳中能起治疗作用的地塞米松最低浓度是多少，但从理论上说，在内耳中的地塞米松浓度相对较高，治疗效果会更好。相对于外淋巴液，内淋巴中药物浓度比外淋巴更为重要。

本研究在动物实验中以地塞米松磷酸钠为药物示踪剂，应用高效液相色谱技术，了解耳后皮下给药及鼓室给药后地塞米松磷酸钠的有效药物成分地塞米松在豚鼠外淋巴液的药代动力学特征。通过耳后给药及鼓室给药两种方式，药物均可进入内耳，给药后0.5～8h外淋巴液中均能检测出有效药物成分地塞米松的浓度，但鼓室组不同时间点下对应的药物浓度均较耳后组高，鼓室给药药物在外淋巴液中的达峰时间长，峰浓度高，且总的药物吸收量大。①外淋巴液中药物达峰浓度（Cmax）比较：耳后给药组及鼓室给药组Cmax分别为18.83mg/L、906.55mg/L；两组的峰浓度比较均有显著性差异（P＜0.001）。提示：鼓室给药可达到较高的峰值。②外淋巴液中药物达峰时间（Tmax）比较：耳后组、鼓室组Tmax分别为：0.25h、3h。提示：两组的达峰时间不同，耳后组达峰值时间短。③外淋巴液中药时曲线下面积（AUC：评估进入体内药量多少的一个客观指标)比较：耳后组及鼓室组AUC分别为129.41mg/L·h、2998.40mg/L·h；两组的AUC比较均有显著性差异（P＜0.001）。

两种方式给药后外淋巴液的地塞米松Cmax与AUC有显著差异，可能与两种给药途径药物进入内耳的机制不同有关：①耳后给药药物通过耳后区局部静脉回流，经乳突导静脉及髁管导静脉大部分直接回流至乙状窦，再通过乙状窦与内淋巴囊之间密切的脉络关系，作用于内淋巴囊，进而通过内淋巴囊直接进入膜迷路对内耳发挥药效，即通过局部的直捷通路进入内耳，故达峰时间短。②鼓室给药后，药物通过圆窗膜渗透进内耳，避开血脑屏障及血迷路屏障。由于鼓室体积较小，限制了给药剂量，临床上需要反复穿刺给药，且药物容易经咽鼓管流失，患者所吸收的药物量不容易估计，且不能保持持续恒定浓度。地塞米松经鼓室给药不会对耳蜗的结构和功能造成影响，之前有研究采用地塞米松溶液鼓室注射的方式给药，结果表明地塞米松在外淋巴中虽能达到较高浓度，但降解很快，维持时间短，需增加用药次数[10，15]。

两种局部给药总量本研究中两组的给药浓度均为10mg/ml，由于中耳腔大小对于给药总量的限制，两组给药总量不一，鼓室给药总量为0.1ml，耳后给药总量为1ml。这点与临床治疗上用量相符，即鼓室给药总量小。鼓室给药总量相对耳后给药小，各时间点下的浓度较耳后高，但鼓室达峰浓度时间较长，药物半衰期相对较小，即在外淋巴液中维持时间短，需要重复给药维持浓度，临床上运用较之耳后有创，这就表明耳后皮下注射在临床运用的可行性及优越性。

综上可见，耳后给药与鼓室给药的药代动力学不同。耳后给药药物达峰浓度时间快，半衰期较长，起效相对鼓室给药快，且维持时间较鼓室给药长，但耳后给药浓度相对鼓室给药低，结合临床观察，耳后给药的有效性，可以推测：药物在内耳的浓度不需要太高即可发挥药效，但具体起到治疗作用的药物浓度为多少是目前暂不知道的，需要进一步的实验探讨。

1 Praetorius M,Limberger A,Muller M,et al.A novel microperfu⁃sion system for the long-term local supply of drugs to the inner ear: implantation and function in the rat model[J].Audiol Neurotol，2001，6(5)：250-258.

2 Imamura S,Honda H,Miyata M,et al.Clinical statistics of recurrent acute low-tone senseorineural hearing loss.Nippon J ibiinkoka Gak⁃kai Kaiho，2007，110(7)：520-526.

3 Fauser C,Schratzenstaller B,Gloddek B.Sudden sensorineural hear⁃ing loss:does application of glucocorticoids make sense?Arch Oto⁃laryngol Head Neck Surg，2001，127(3)：253-258.

4 Selivanova OA,Gouveris H,Victor A.Intratympanic dexamethasone and hyaluronic acid in patients with low-frequency and Ménière's-associated sudden sensorineural hearing loss.Otol Neu⁃rotol，2005，26(5)：890-895.

5 林运娟,余力生.大鼠耳后和肌肉注射地塞米松后内耳组织药物浓度分析.中国耳鼻咽喉头颈外科，2009，16(7)：381-384. Lin Yun Juan,Yu Li Sheng.The concentration analysis of dexametha⁃sone in rats’inner ear tissue after postaurieal injection and muscle injection.Chinese Archives of Otolaryngology Head and Neck Sur⁃gery，2009，16(7)：381-384.

6 Ruckenstein MJ.Autoimmune inner ear disease[J].Curr Opin Oto⁃laryngol Head Neck Surg，2004，12(5):426-430.

7 Kilic R,Safak MA,Oguz H,et al.Intratympanic methylprednisolone for sudden sensorineural hearing loss[J].Oto Neurotol，2007，28(3)：312-316.

8 Ye Q,Tillein J,Hartmann R,et al.Application of a corticosteroid (Triamcinolon)protects inner ear function after surgical intervention [J].Ear Hear，2007，28(3)：361-369.

9 Haynes DS,O’malley M,Cohen S,et al.Intratympanic dexametha⁃sone for sudden sensorineural hearing loss after failure of systemic therapy[J].Larygoscope,2007,117(1):3-15.

10 迟放鲁,刘宏建,董明敏.地塞米松经鼓室给药对豚鼠耳蜗结构和功能的影响.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2005，40(6)：440-443. Chi Fang Lu,Liu Hong Jian,Dong Ming Min,The effect of dexametha⁃sone on the structure and function of the guinea pig’s cochlea after intratympanic injection.Chinese Arhieves of Otolryngology Head and Neck Surgery，2005，40(6)：440-443.

11 Charabi S,Thomsen J,Tos M.Round window gentamicinu-caheter a New therapeutic tool in Meniere’s disease[J].Acta Otolaryngol Suppl，2000，543：108-110.

12 杨晓琦，余力生，马鑫.耳后注射复方倍他米松治疗顽固性低频型感音神经性聋[J].中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2007，42(11)：814-816. Yang Xiao Qi,Yu Li Sheng,Ma Xin.Compound betamethasone after postaurieal injection treat resistant low-frequency sensorineural hearing loss[J].Chinese Archieves of Otolaryngology Head and Neck Surgery，2007，42(11)：814-816.

13 静媛媛，李兴启，余力生.耳后注射复方倍他米松豚鼠血浆中药代动力学特征.听力学及言语疾病杂志，2009，17(4)：354-357. Jing Yuan Yuan,Li Xing Q,Yu Li Sheng.The pharmacokinetics of compound betamethasone in guinea pig’s plasma after postaurieal injection.Journal of Audiology and Speech Pathology，2009，17(4): 354-357.

14 李晶兢，余力生.7．0T磁共振成像观察耳后给药促进药物进入内耳的可行性.中华耳科学杂志，2012，10(2)：144-148. Li Jingjing,Yu Li Sheng.7.0 T magnetic resonance imaging to ob⁃serve the feasibility of postaurieal injection promoting drugs into the inner ear.Chinese Journal of Otology，2012，10(2)：144-148.

15 孙爱华，Parnes LS，Freeman DJ，等．不同用药途径地塞米松在内耳液中的分布．中华耳鼻咽喉科杂志，2001，36（1）：62-63．Sun Ai Hua,Parnes LS,Freeman DJ,et al.The distribution of dexa⁃methasone in the inner ear after various methods of administration. Chinese Archives of Otolaryngology Head and Neck Surgery，2001，36（1）：62-63．

Dexamethasone concentration in perilymph following post-aural or intratympanic Injection

SHI Jiao,HAN Lin,LI Jingjing,JING Yuanyuan,ZHENG Hongwei，YU Lisheng
Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery，People’s Hospital，Peking University，Beijing 100044，China

ObjectiveTo compare dexamethasone concentration in the perilymph(PL)after post-aural or intratympanic injection in guinea pigs.Methods Dexamethasone sodium phosphate(10 mg/ml)was injected post-aurally(1 ml)or intratympanically(0.1 ml)in guinea pigs.Samples of perilymph were obtained at 0.25,0.5,1,2.5,5,6 and 8 hours after post-aural injection and at 0.5,1,2,3,4,6 and 8 hours after intratympanic injection respectively.High-performance liquid chromatography（HPLC）was used to assay dexamethasone concentration in the samples.Results①dexamethasone was detected in the inner ear following both modes of injection;②Following intratympanic injection,active pharmaceutical ingredients were detected from 0.5 to 8 hours in the perilymph,peaking at 3 hours with a peak concentration(Cmax)of 906.55mg/l and a biological half-life of 1.27 hours.③After post-aural injection,dexamethasone was detected from 0.25 to 8 hours with a peak time(Tmax)at 0.25 hour,a Cmax at 18.83 mg/l and a biological half-life of 3.36 hours.④The perilymph dexamethasone concentration was lower but half-life longer after post-aural injection than after intratympanic administration.Conclusion Drugs may enter the perilymph space by various ways after post-aural injection,although drug concentration may be relatively lower compared to intratympanic administration.As the intratympanic route bypasses the blood-brain and blood-labyrinth barriers,drugs through this route may gain access into the perilymph faster and reach higher concentrations than when given via post-aural injection.Clinical observation,however,seems to suggest that onset of corticoids effects may start at a relatively low concentration in the perilymph.

Dexamethasone Sodium Phosphate；Post-aural Injection；Intratympanic Injection；Pharmacokinetic

R764

A

1672-2922（2016）04-540-5

2015-11-5 审核人：郭维维）

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.04.022

①北京大学临床研究项目；课题名称：耳后注射糖皮质激素治疗突发性耳聋的多中心、开放、随机、对照临床试验。课题编号：PUCRP201307②国家自然科学基金；课题名称：一种新的给药方式——耳后给药治疗内耳疾病的作用途径及机制研究。课题编号：81070780

石茭，博士，医师，研究方向:耳鼻咽喉科临床及基础研究

余力生，Email:yulish68@163.com