孙捷 贺楚峰 牛志杰 文杰 冯永 陈红胜

1中南大学湘雅医院耳鼻咽喉头颈外科学（长沙41000）

2新疆医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科学（乌鲁木齐83000）

·临床研究·

一噪声相关常染色体显性遗传耳聋家系遗传性分析

孙捷1，2贺楚峰1牛志杰1文杰1冯永1陈红胜1

1中南大学湘雅医院耳鼻咽喉头颈外科学（长沙41000）

2新疆医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科学（乌鲁木齐83000）

目的 分析一个与噪声接触相关的常染色体显性遗传性耳聋家系的听力学及遗传学特征，制定致聋基因鉴定策略。方法对该常染色体显性遗传性耳聋家系进行问卷调查，听力学检测及全身体查，绘制该耳聋家系的遗传图谱，分析其听力学及遗传学特点。应用Sanger测序技术进行候选基因鉴定。结果该家系共5代，进行听力学检测者为13人，听力下降者6人，其中3人有明显的噪声接触史。听力学表现为双侧迟发性感音神经性耳聋，先以高频听力损失为主，随后逐渐加重累及全频听力下降，听力开始下降年龄在16-37岁之间。起病后3年症状明显加重。应用Sanger测序技术进行候选基因鉴定，未发现致聋突变位点。结论 这个家系成员为高频听力下降为主的迟发性感音神经性耳聋，符合常染色体显性遗传非综合征型耳聋特点，且怀疑有噪声易感因素。计划下一步通过对家系的表型分析运用新一代测序技术希望鉴定出该家系的致聋基因。

常染色体显性遗传；遗传性耳聋；表型；二代测序

We thank the patientsand the other participants who took part in this study for their collaboration.This work was supported by the National Nature Science Foundation of China(Grant No.81170923,81470705,81300833,81500803).

The authors declare that we have no competing interests.

耳聋作为一种常见的致残性疾病，越来越多的引起社会的关注，是全球面临的重大公共卫生问题。在引起耳聋的众多原因中，遗传因素占据了主导地位[1-2]，有近60%的耳聋患者有遗传背景，即遗传性耳聋（hereditary hearing loss，HHL），而其中68%的患者一出生就有听力损失，55%的患者从幼年时开始慢慢表现出听力下降直至全聋。在美国，每年新生儿确诊为遗传性耳聋的就可达1.9‰[3]。遗传性耳聋依据是否伴有全身其他组织疾病分为非综合征性耳聋（nonsyndromic hearing loss，NSHL）和综合征性耳聋（syndromic hearing loss，SHL），所占比例分别是70%和30%。目前克隆出了有关NSHL的基因有92个，其中与语后聋相关的有28个。

本课题小组在中南大学湘雅医院耳鼻咽喉科头颈外科门诊接诊了一个来自湖南省张家界市的非综合征性语后聋家系，并分析了该家系内成员的听力表型及遗传学表型特征，应用当前的测序技术，制定出后续的基因筛查策略。

1 资料与方法

1.1 家系资料

本研究的家系信息调查取样工作在事先取得了湘雅医院伦理委员会的伦理认证及认可后，由中南大学湘雅医院耳鼻咽喉头颈外科学耳科组成员完成。该家系位于湖南省，命名为HN-HL03。2015年11月，中南大学湘雅医院耳鼻咽喉头颈外科学耳组成员到当地对此家系成员的疾病发展情况进行了调查。本次调查取样原则上尽可能收集所有在世家系成员，包括正常人和耳聋患者,以便对照研究。无论有无听力下降主诉，均进行听力测试以获得准确的听力学资料。调查过程中签署耳聋基因筛查知情同意书，填写问卷调查，有一名教授负责全身体格检查及详细的耳科专科检查，一名副教授进行听力学检测，保证数据可靠、准确。采取每一位参与调查者外周血3-8ml，冰盒保存。于第二日统一送中南大学国家遗传实验室进行外周血DNA提取，并-20°保存，同时运用淋巴母细胞法建株，收集家系成员细胞并永久保存，日后可以复苏解冻细胞，反复提取DNA。

1.2 表型判断标准

根据听力损失性质分为感音神经性耳聋、传导性耳聋及混合性耳聋，依据发病时间出生前后分为先天性聋和后天性聋，又以语言功能发育程度划分为语前聋和语后聋。按NIH＆WHO（2000）标准，根据听力损失的频率将耳聋表型分为：高频听力损失型（2－8kHz听力下降为主），低频听力损失型（0.25－1.00kHz听力下降为主），中频听力损失型（0.25－2.00kHz听力下降为主），全频听力损失型（0.25－4.00kHz听力下降）。听力损失的评定：以相对好耳0.5、1.0、2.0、4.0Hz频率的气导平均值为基准评定听力损失的程度：20－40dBHL为轻度听力损失，＞40－70dBHL为中度听力损失，＞70-95dBHL重度听力损失，＞95dBHL为极重度听力损失。详细询问病史、听力学检查进行听力损失分型有助于判断不同表型的耳聋类别，进一步指导相应的遗传学检测工作。

1.3 听力学检测

应用Madsen 502便携式听力计（丹麦）及EAR-3A插入式耳机（美国）对家系成员进行纯音测听检查（检测环境尽量做到密闭、安静），初步了解该家系听力情况及病变性质。

1.4 耳聋基因芯片测试结果

运用中南大学湘雅医院研制开发的耳聋基因芯片检测 3个基因 8个位点（GJB2 c.235delC、c.299-300delAT、c.176del16bp、c.35delG、SLC26A4基因的IVS7-2A＞G、2168A＞G、线粒体、12SrRNA基因1555A＞G、1494C＞T）。

1.5 应用Sanger测序技术在候选基因中进行致聋基因突变位点鉴定

通过对家系病人临床听力学特征分析考虑为语后高频下降为主的常染色体显性遗传，依据本家系耳聋临床特征，在已知常染色体显性遗传耳聋基因（http://hereditaryhearingloss.org/）中筛选有与本家系耳聋特征相似报道的基因作为候选基因筛选候选基因为，DFNA3A(GJB2)是我国常见耳聋致病基因、DF⁃NA2B（GJB3）、DFNA9（COCH）都有过常染色体显性语后聋案例报道，且也表现为高频下降为主，呈进行性加重表现[4]。

2 结果

2.1 家系基本资料

HN-HL03家系遗传图谱（见图1），本研究家系现存成员5代32人，年龄最长者63岁，最小者4岁。其中有耳聋病史者9人；能调查到的有13人，除离世1人，失联2人，确定患有感音神经性耳聋者6人。接受听力检测者13人，平均年龄43.6岁，其中女性5例，男性8例。先证者（IVⅢ：4）为女性，37岁，全频听力下降，高频为主，陡降型，伴有间断高调蝉鸣样耳鸣3年，无眩晕发作。所有受检者均无眩晕病史、外伤史及耳毒性药物接触史，全身系统检查未见其他明显异常，3例伴有不同程度、不同性质耳鸣。6例耳聋患者均明确记得出现耳聋的年龄，而且是听力下降症状早于耳鸣症状出现。起病年龄16-37岁不等，呈现逐渐加重趋势。值得注意的是：6例耳聋患者中有3例有明显噪声接触史，ⅢⅡ：5，有两年炮兵经历史经历，当兵前听力基本正常（19岁参军，25岁发病），Ⅱ：7长期在戏院工作至今（23岁入职，28岁发病），Ⅲ：5在电厂车间工作（28岁入职，30岁发病），机器轰鸣声较大，说话需大声呼喊。

图1 HN-HL03家系遗传图谱Fig.1 Pedigree of family HN-HL03

2.2 家系听力学特征及遗传学特点

本家系能追溯到的仅有5代成员，因Ⅰ代成员去世或失去联系多年，所以无法考证上一辈家人听力情况，第ⅡⅠ代有3名女性成员发病，第ⅢⅡ代6名成员中有4名发病，其中3男1女；第IVⅢ代8名成员中现已有两名30岁以上成员发病，其余年龄低于30岁。（见表1）

家系成员中连续3代均有发病，起病年龄16-37岁不等，但6例患者均能准确地回忆出听力开始下降的年龄，随后病例呈现逐渐加重趋势。发病时间3年以内的，听力检测表现为高频陡降型，伴有低频缓降。IVⅢ：4是先证者，以发现听力下降3年伴有耳鸣为主诉就诊，其听力言语辨别能力明显下降，伴有间歇性高调蝉鸣。家系谱图中最初患者为女性，结过两次婚，与前夫后裔这里标记为A支家系，第二代只育有一名男性（ⅢⅡ：1）为所有后裔中年长者，至今听力正常，第IV三代两名男性，听力未见异常。而二婚后代标记为B支家系，第Ⅲ二代有五个子女（三男两女），4个患病（三男一女），患病率达80%，第IV三代子女有6人，三男三女，现有两名年龄超过30者出现听力下降症状，发病率33.3%，其余年龄低于30岁，未出现听力异常情况。该家系每一代都有耳聋患者，男女各有患病，发病年龄在16-37岁之间，有延后趋势。

此家系遗传特点如下：⑴连续三代发病；⑵男女均有发病；⑶语后聋；⑷迟发性耳聋（16岁以后发病）；⑸听力下降最初以高频下降为主，最终发展为全频损失；⑹呈逐渐下降趋势；（7）6例耳聋患者中有3例有明显噪声接触史；是典型的常染色体显性遗传的非综合征性语后聋家系，高度怀疑与噪声有关。

2.3 耳聋基因芯片检测结果

3个基因8个位点（GJB2 c.235delC、299-300de⁃lAT、176del16bp、35delG、SLC26A4基因的IVS7-2A＞G、2168A＞G、线粒体12SrRNA基因1555A＞G、1494C＞GT）的检测为阴性，除外以上基因位点致聋可能。

2.4 应用Sanger测序技术在候选基因中进行致聋基因突变位点鉴定

选取了最常见的显性遗传基因COCH,GJB3和GJB2基因对先证者IVⅢ：4进行PCR扩增、酶切纯化、测序分析，没有发现突变位点。

图2 HN-HL03家部分成员系听力图Fig.2 audiogram of HN-HL03

3 讨论

针对本研究报道的家系，具有典型的常染色体显性遗传的非综合征性语后聋遗传学特征，临床听力学表现为双耳对称性、语后进行性感音神经性耳聋，发病年龄16-37岁之间，始发以高频听力减退为主，3年后逐渐发展为全频听力损失，严重的呈孤岛型听力曲线，可伴有高调耳鸣，无前庭功能障碍。三例患者有明确的长期噪声接触史，且分析噪声强度达80分贝这里高度怀疑是因噪声环境因素诱发相关的遗传性耳聋。

目前国内大规模聋病基因筛查已经得到大量热点突变数据，本文针对GJB2、SLC26A4、线粒体12SrRNA 3个常见耳聋基因的8个热点（235delC、299-300delAT、176del16bp、35delG、IVS7-2A＞G、2168A＞G、12SrRNA基因1555A＞G、1494C＞T）检测均为阴性，常见常染色体显性遗传耳聋基因GJB2、GJB3、COCH外显子测序检测未发现突变位点[5-6]。基因芯片筛查受限于分子杂交的局限性，近期目标区域富集结合二代测序新技术的出现[7-8]，给基因诊断甚至未知基因的鉴定带来了新机遇，可以实现覆盖了所有已知耳聋基因的完整分析[9-10]，应用目标序列捕获二代测序技术全面、高效的排除已知耳聋基因的诊断后，再补充连锁分析结合全外显子组测序，可以鉴定克隆出耳聋家系致病基因[11]。因此本家系研究下一步将先选取两名血缘关系较远的患者DNA模板和一位关系较近的正常者DNA模板进行全基因组测序，依据结果分析候选致病基因，然后进行家系所有成员的候选基因筛查，确定候选基因与耳聋在家系中共分离，最终确定耳聋致病基因。

表1 HN-HL03家系听力损失特点Table 1 Family Characteristics of Hearing Loss

表2 COCH基因编码区突变检测引物一览表Table 2 primer List of COCH gene

表3 GJB2基因编码区突变检测引物一览表Table 3 primer of GJB2

表4 GJB3基因编码区突变检测引物一览表Table 4 primer of GJB3

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Audiologic and genetic features of a Chinese family with nonsydromic autosomal dominant hearing loss associated with noise exposure

SUN Jie1,2,HE Chufeng1,NIU Zhijie1,WEN Jie1,FENG Yong1,CHEN Hongsheng1
1 Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery,Xiangya Hospital,Central south University, Changsha,410008,China
2.Department of Otorhinolaryngology,First Affilicated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi,830011,China

Objective To report audiologic and genetic features of a Chinese family with nonsydromic autosomal dominant hearing loss associated with noise exposure and establish the identification strategy of induced deafness.Method A pedigree with autosomal-dominant inherited postlingual progressive bilateral sensorineural hearing loss was investigated.Medical and detailed audiological examination were completed in all study participants.Candidate genes were tested by Sanger sequencing.Results Thirteen members of the family participated in this study,and 6 showed hearing impairment,which mainly affected high frequencies initially,with lower frequencies becoming involved with increasing age,gradually progressing to all frequency hearing loss.The age of onset varied from 16 to 37 years.Candidate genes were preliminary excluded by Sanger sequencing.Conclusion Pedigree analysis suggests an autosomal dominant inheritance pattern in this family.

autosomal-dominant;hearing loss;hereditary;NGS

R764.43

A

1672-2922（2016）04-535-5

2016-1-18审核人：翟所强）

10.3969/j.issn.1672-2922.2016.04.021

国家自然科学基金项目（Grant No.81170923，81470705，81300833）国家青年科学基金81500803

孙捷，博士，职称:副主任医师，研究方向:遗传性聋为主的耳科学基础与临床研究

冯永，Email:fengyong_hn@hotmail.com